原位杂交技术ppt课件.ppt

1、李成仁 组织胚胎学教研室 Tel：752220，Email：,第四章 原位杂交技术,形态学实验技术,1,中心法则,免疫组织化学,？,核酸分子原位杂交,2,一、核酸分子原位杂交的基本概念,(一)定义 用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交, 从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定量分析。,简称原位杂交,3,(二) 基本原理,碱基互补配对原理,4,加热变性,杂交反应,酶标记的抗探针标记物的抗体,酶显色反应,带标记物的探针,5,定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开 成两条单链的过程。 方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、 甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。

2、,(三)DNA变性(denaturation),本质是双链间氢键的断裂,6,解链曲线,热变性,变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，双链DNA变性一半所需要的温度称为DNA的解链温度，又称熔解温度, Tm)。其大小与G+C含量成正比。,熔解温度(, Tm),Tm=（G+C）%0.41+69.3,7,在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复双螺旋构象，这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，又称为退火。,DNA复性,复性,RNA,DNA,8,(一)定义：,是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试

3、剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上,二、探针（probe）,9,(二)探针的分类,根据探针的核酸性质分为,DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针、寡核苷酸探针,10,1. cDNA(complementary DNA), 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 较不易被降解 标记方法可靠易行,优点,互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对）,11,优点： 杂交效率比DNA探针高 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解,2. RNA,RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对）,1

4、2,根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上合成 优点：形成杂交体快速(序列短，杂交时易于穿透) 缺点：特异性较低（短链和简单）,3. 寡核苷酸,短链探针(长度10-50个核苷酸),13,1. 标记物 3H、32P、35S、125I等。,(三)探针的标记,(1)放射性标记物,特点：敏感性高 半衰期，放射性污染，成本高，耗时长,Vermot J. 2000. Endocrinology.,Xie HR et al. 2007. PANS,35S,35S,14,(2)非放射性标记物 生物素、荧光素、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。,特点：性能稳定，操作简便，成本低、耗时短，标记探针可较长时间的保

5、存和使用,15,特点：敏感性与放射性核素标记的探针相似 较放射性标记系统安全，方便、省时间 定位准确，杂交背景好,地高辛（Digoxigenin 简写Dig-） 类固醇半抗原分子 人及多种动物体内不存在类似的物质，无交叉反应,16,17,地高辛标记探针的显色检测,常用免疫酶学显色检测方法有两类： Dig-HRP检测系统 以DAB/H2O2为底物，结果为棕色； 以4-氯-1-萘酚/ H2O2为底物，结果为蓝色。 Dig-AKP检测体系 以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。,18,Diao HL. 2007. Fertil 杂交液的量要适当，以1020l/每张切片为宜,1. 探针准备,36

6、,理论热变性温度：9095 甲酰胺法：常规的加入3050%甲酰胺于杂交液中 每增加1%，Tm值降低0.72，降至37-40 为宜 注意：在每次变性后，都需要将样品用冰迅速冷却，以保持变性后单链状态。,当靶核酸或探针为DNA时，杂交前需要变性为单链,2. 探针和靶核酸变性,37,探针预变性的探针 高浓度盐类(柠檬酸钠)增加杂交体的稳定性 甲酰胺可降低解链温度 硫酸葡聚糖对DNA有浓缩作用，可提高杂交的反应速度10倍以上，但不影响探针的洗脱强度 牛血清白蛋白和鲑鱼精DNA或RNA用于阻止探针与非特异位点或非目标DNA杂交。,3. 杂交液的组成,38,方法：杂交液滴于切片上，加盖硅化的盖玻片。 杂交

7、的温度：在Tm-25左右，大约在3060之间 时间：1620小时，一般过夜。 PH：6.57.5,含50%甲酰胺、盐浓度0.75mol/L左右时，杂交温度： DNA探针是42 RNA探针是50-55 寡核苷酸探针是37,4. 温度、时间和PH,39,目的：尽可能洗去未杂交或非特异性吸附的探针。 方法：系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。 RNA探针杂交后漂洗液中的可加入RNA酶 原则：是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高,(五)杂交后处理,40,(六)杂交体的检测 生物素标记的探针 地高辛标记的探针,酶标记卵白抗生物素抗体,酶标记链霉抗生物素抗体连接,酶标记抗地高辛抗体,标记酶：HRP、AlP

8、,41,42,43,44,(七)原位杂交详细步骤,1、二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。DEPC水洗2次， DEPC-PBS洗2次，5分钟 2、DEPC-PBS处理的Triton-X100处理15分钟 3、DEPC-PBS洗2次，5分钟 4、TE缓冲液稀释的蛋白酶K（5-20g/m l）37孵育1520min,45,5、用0.1mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗1min终止蛋白酶K的消化，DEPC-PBS洗2次，5分钟 6、DEPC-PBS-4%多聚甲醛后固定 10-15分钟 7、DEPC-PBS洗2次，5分钟 8、2SSC洗5分钟 9、不含探针的杂交液中37孵育2h,46,10、2SSC洗5分

9、钟 11、含探针杂交液中37(42-55)孵育18h 12、1SSC在室温下速洗， 1SSC在55 水浴摇洗，215min，0.5 SSC在55 水浴摇洗215min， 0.5 SSC在室温下洗10min 13、放射自显影或酶显,47,目的：保障实验结果的准确性和特异性 标本对照、探针对照、杂交体对照、检测系统对照 阴性对照：排除非特异性杂交等因素造成的假阳性 阳性对照：证明杂交步骤及试剂可靠性 对照实验设置愈多，实验结果的可靠性就愈大。 注意：每次实验都应有阳性对照和阴性对照,四. 对照实验的设置,48,常用的实验对照 (1)标本对照：选用已知为阳性或阴性的组织 (2)空白实验: 无探针的杂

10、交液进行杂交 (3)选用其他生物学方法进行对照实验 提取标本DNA和RNA进行Southern和Northern印记杂交、qPCR、RT-PCR等。,49,（4）RNA酶或DNA酶预先处理标本后杂交反应 （5）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关的核酸探针进行杂交。 （6）探针孵育后的检测系统对照,50,1. 标本形态结构不佳 取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解 杂交预处理中蛋白酶消化不当所致 杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮或脱片,五. 实验结果可能的问题和原因,51,2. 杂交信号弱 探针链太长不易深入细胞 探针的标记不好 靶序列暴露程度不佳 探针和（或）靶序列的变性条件欠佳

11、,52,3. 无杂交信号 标本内无靶序列的存在 标本内存在靶序列，因实验某个环节的失误导致后者可能降解,53,4. 非特异性着色 探针特异性 组织细胞内的内源性酶 组织细胞内的某些成分与检测系统的抗体非特异性结合,54,基本实验过程总结,放射自显影,免疫细胞化学,样品制备,切片,探针制备、标记,纯化,通透处理,变性, 原位杂交 ,杂交体探测：,小结,55,Thank you！,56,常用试剂,14%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA） 配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至6065，使成乳白色悬液。用1.0mol/L

12、的NaOH调pH值至7.0，使呈清亮状，再加入约500ml 2PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4保存备用。,57,注意：配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；加热时，温度不宜过高，常为6065，否则，PFA降解失效；配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，建议尽早使用。,58,2、杂交用液 1)SSC (Standard Saline Citrate) 通常配成10，20，50的储备液，如下：,59,先称取上述两种试剂，溶于约800ml ddH2O中，滴加1