PCR HPV-DNA荧光定量检测标准操作程序

1、单位及实验室名称项 目编号：ASJYK-LAB-C-P-53日期：2015年6月21日版本：第一版，第1次修订第1页，共3页检验科HPV-DNA扩增荧光定量检测标准操作程序1.目的：明确高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行巨细胞病毒核酸定量的检测。2.适用范围：2.1适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。2.2适合仪器：LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪2.3方法原理：采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术2.4样品要求：宫颈脱落细胞3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。4.试剂来源：潮州凯普生物化学有限公司高危型人乳头瘤病毒核酸定

2、量检测试剂盒。5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒6.标准操作：6.1 试剂准备（在试剂准备区操作）6.1.1将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（临用前取出，用后立即放回冰箱，反复冻融不可超过三次），取出PCR MIX,室温下避光解冻，上下颠倒混匀后，8000转/分钟10s从试剂盒中取出DVA聚合酶，8000转/分钟lOs。6.1.2根据当次实验标本量，取出相应试剂（1管=17.5ulPCR MIX +0.5ul DVA聚合酶）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为n (n=标本数+1空白管对照+1管阳性对照) 取PCR反应管转移至样本制备区。6.2样

3、本处理(在样本处理区进行)6.2.1.取宫颈脱落细胞样本0. 5ml1ml(如果细胞数量少可以加大体积到2m1)6.2.2. 13000转/分钟离心1分钟6.2.3.弃上清，加入0.5m1细胞保存液重悬细胞6.2.4. 13000转/分钟离心1分钟，尽量弃干净上清6.2.5.每样本加入50ul细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸10分钟。6.2.6. 13000转/分钟离心10分钟，保留上清备用(上清中为释放的DNA)。6.2.7取上清2.0ul作为PCR扩增的模板，其余保存于一206.2.8在对应的PCR反应管中分别加入2ul处理好的样本DVA,空白对照、阳性对照，盖紧管盖，稍做离心(反应总体

4、积为2o u 1/人份，每次反应需要设置一个阳性对照以及一个空白对照)。转移到检测区，放入相应的荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序6.3 PCR扩增（在扩增区操作）6.3.1打开稳压器电源，再打开计算机电源。6.3.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。6.3.3设置四种荧光检测通道的报告荧光、淬灭荧光;Passive Reference选择none(见表1)ASJYK-LAB-C-P-53 第2页，共3页表1: 设置四种荧光检测通道Detector NameTargetReporter DyeQuencherFAM12种高危型HPV (31, 33, 35,39, 45,

5、 51, 52, 56, 58, 5966，68)FAMnoneHEMHPV16HEX/JOEnoneROXHPV18ROX/Red 610noneCy5-globinCy5none6.3.4将循环条件设定为ProgramCyclesTemperature ()IncubationTime(min:sec)TemperatureTransitionRate(/sec)AcquisitonModeAnalysisMode119510:00min20NoneNone2459515sec20NoneNone6060secSingleQuantification31385sec20NoneNone6.

6、3.5检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。6.3.6将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中设定好样孔位置。6.3.7按仪器操作规程开始循环。6.3.8扩增结束后取出PCR反应管，关闭扩增仪电源，反应管直接放入焚烧垃圾桶内。ASJYK-LAB-C-P-52 第3页，共3页6.3.9分析数据，在Analysis Notes窗口中注明检测基线值、试剂批号、阳参批号等相关信息，进行结果分析。6.3.10关闭计算机。6.4检验结果判断：6.4.1基线，阂值的设定:基线的确定为:取3-15个循环的荧光信号:阈值设定:使阈值线超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪

7、音线)的最高点，且Ct值为Under6.4.2质控对照1阴性对照Ct值均应显示为Undet2阳性对照Ct值363内对照-globin在Cy5通道Ct值40符合以上三个条件，此反应是为有效6.4.3结果判断1样本在FAM、HEX、ROX通道Ct值显示为Undet，内对照-globin在Cy5通道Ct值40,判断为阴性2样本在FAM、HEX、ROX通道Ct值40, 内对照-globin在Cy5通道Ct值40判断为阳性 3若样本在FAM、HEX、ROX通道40Ct值45的样本建议重做，重做结果Ct值40者为阳性，否则为阴性7.支持性文件：7.1 高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒(PCR一荧光探针法)说明书（潮州凯普生物化学有限公司）7.2 检测结果报告程序。