叶绿素荧光是光合作用研究的探针.ppt

1、叶绿素荧光是研究光合作用的探针 叶绿素荧光是研究光合作用的一个敏感的探针，叶绿素荧光分析具有灵敏、简便，快速和对植物无破坏损伤的特点。它既可以用于叶绿体、叶片，也可以遥感用于群体、群落。它既是室内光合基础研究的先进工具，也是室外自然条件下诊断植物体内光合机构运转状况、分析植物对逆境响应机理的重要方法。 20世纪80年代以来，调制荧光仪，特别是便携式荧光仪的商品化，使荧光分析在光合作用研究中得以广泛应用。而且它在与光合作用紧密相关的植物学和农学等许多学科的研究中也得到广泛的应用。,叶绿素荧光动力学研究得到广泛应用的原因 1、包含着光合作用过程的丰富信息 光能的吸收与转换 能量的传递与分配 反应中

2、心的状态 过剩光能及其耗散 光合作用光抑制与光破坏等等 2、可以对光合器官进行“无损伤探查”，获得 “原位”的（in situ）信息。 3、近年来测定仪器的性能和自动化程度越来越高，操作步骤越也来越简便。,特别是在植物抗性生理、植物生态学、作物生理学以及藻类学的研究中取得了众多研究成果。 从应用方面，叶绿素荧光，特别是叶绿素荧光动力学，已经在鉴定植物的各种抗性、筛选抗除草剂植物、检测环境污染及植物对污染的反应、作物增产潜力苗期预测、甚至植物遥感和营养缺乏症等许多领域得到应用。,一叶绿素荧光的发现： Brewster(1834)在观察一束太阳光通过月桂叶片的乙醇提取液时，在反射光方向看到的是红色

3、，而不是绿色。 1852年，Stokes认为这是一种光发射现象，命名为荧光（fluorescence）。,二叶绿素荧光的来源及其量子产量 光合机构吸收的光能有三个可能的去处： 1.光化学反应（光合作用、光呼吸、氮代谢） 2. 放热，又称非辐射能量耗散 3. 发射荧光 这三者之间存在此消彼长的竞争关系，所以可以通过荧光的变化探测光合作用的变化。 通常色素分子是处于能量的最低状态基态，吸收一个光量子后，会引起原子结构内电子分布的重新排列。其中一个低能的电子获得能量而成为激发态。,激发能,光化学反应形成同化力,热耗散,荧光,CO2固定 光呼吸 Mehler 反应 N代谢,从 Chl b到Chl a的

4、传递效率几乎达100，故检测不出Chl b的荧光。植物体内发射的荧光大部分来自PSII天线色素系统(Chlorophyll-a fluorescence) , 而PSI色素系统基本不发射荧光。实际上，荧光发射出的光能在数量上是很少的，还不到吸收总光能的3。 在理论上，荧光量子产量（f）的定义为： f=F/Ia F-发射荧光量子总数 Ia-吸收光量子总数 f 的大小取决于各种去激途径的竞争。,若Kf、Kh、Kt、Kq和Kp分别代表荧光、热耗散、激发能传递、荧光猝灭和光化学反应的去激速度常数，则Chl a荧光量子产量（f）与各种K的关系如下： fKf/Kf+Kh+Kt+Kq+Kp 在以上各种去激途

5、径中，f受Kp的影响最大。 在弱光下，PSII原初电子受体QA处于完全氧化状态（即PSII反应中心开放），这时： KpKf+Kh+Kq+Kt 则所吸收的光量子90以上用于光化学反应，结果得最小的f（约0.6%）,在饱和光下, 当QA完全还原时(即PSII反应中心关闭)，此时 Kp0，其f最大（约3，肉眼难以观测到）。由此可见，植物体内荧光去激途径仅占总去激途径的一小部分。在溶液中，f 可达30。,三、叶绿素荧光诱导动力学及其测量 叶绿素荧光诱导现象是1931年由德国Kautsky首先发现的，所以又称Kautsky效应。叶绿素荧光诱导动力学是指当暗适应的绿色植物材料转到光下时，其体内叶绿素荧光强

6、度会产生有规律的随时间的变化（图）。 有几个特征性的点，分别被命名为O、I、D、P、S、M和T。 在照光的第一秒钟内，荧光水平从O上升到P, 这一段被称为快相；在接下来的几分钟内，荧光从P下降到T，这一段被称为慢相；快相与PSII的原初过程有关，慢相则主要与类囊体膜上和间质中的一些反应过程有关。,经过暗适应后的叶片从黑暗中转入光下，叶片的荧光产量随时间而发生的动态变化，称为Kautsky效应，荧光的这种动态变化所描绘出的曲线即Kautsky 曲线。 完整的Kautsky曲线可分为两部分，从开始照光到荧光产量达到最大值时的荧光上升部分，所用时间很短，只需0.5-2.0s，称为快速荧光动力学曲线；

7、此后，荧光产量降低，并逐渐达到一个稳恒值，时间大致需要8-10min，称为慢速荧光动力学曲线。 荧光产量降低是荧光猝灭(Quench)的结果。所谓荧光猝灭，是指叶绿素吸收光量子后的部分激发能通过光化学途径或以热的方式散失，从而使荧光发射量减少的现象。,叶绿素荧光诱导动力学曲线,非调制式荧光仪： 可把荧光诱导动力学曲线划分为：O点（原点）I（偏转）D（小坑）P（最高峰）S（半稳态）M（次峰）T（终点）这几相（phase）。 其中从OP相为快速上升阶段（约12秒），从PS相为荧光慢速下降（猝灭）阶段（45分钟）。,低温荧光 在77K（196度，液氮中）小，与温度有关的酶反应和电子传递能力对荧光水平

8、的影响被避免，因此只有原初光化学反应被反映出来。 77K荧光是测定PSII光化学效率（Fv/Fm)的一个重要工具，健康植物叶片的Fv/Fm值为0.832。 77K荧光常用于研究两个光系统之间的能量分配。PSI在735nm处的荧光增加往往是PSII向PSI增加分配的结果。,调制荧光 用于测定荧光的光源被调制，也就是使用很高频率不断开关的光源，而且检测器通过选择性放大仅仅检测这种调制光激发的荧光，因此可以在背景光，特别是在田间很强的太阳光存在的情况下测定相对的荧光产额。 荧光猝灭使荧光产量从它的最大值（Fm）下降的各 种过程。分为两大类： 光化学猝灭（qP）, 代表被开放的PSII反应中心捕获并

9、转化为化学能的那部分能量。 非光化学猝灭（qN）, 代表各种非光化学去激过程所耗 散的能量。,调制式荧光仪测定原理,MR-经调制的弱测量光，2mmolm-2s-1，l583nm(绿光)；频率600Hz AR-作用光, 白光, 持续照射, ； SR-饱和脉冲光, 白光, 8500mmolm-2s-1, 照射0.5s FR-弱远红光，7-10mmolm-2s-1；l 700nm ； D-荧光检测器；A-信号放大器；SF-短波滤光片；LF-长波滤光片,荧光猝灭任何使荧光产额低于其最大值的过程。 光化学猝灭由光化学反应引起的荧光产额的降低，它 依赖于氧化态QA的存在。 非光化学猝灭由非光化学过程如热耗

10、散过程引起的荧光产额的降低。 非光化学猝灭涉及三个不同的机理： qE 依赖类囊体膜内外的质子浓度差，暗豫驰的半 时间 T1/2小于1分钟； qT依赖状态1向状态2的转换，增加向PSI的能量 分配； qI与光合作用的光抑制有关，表现为Fv/Fm 的下降。,叶绿素荧光分析方法示意图,荧光参数的意义 Fv/Fm 最大光化学效率 PSII= (FmFs)/Fm PS实际光化学效率 Fv/Fm PS最大天线转化效率 P=PSII PFD 光化学反应速度 NPQFm/Fm1 非光化学猝灭 qp=(FmFs)/(FmF0) 光化学猝灭系数 qN=(FmF0)/(FmF0) 非光化学猝灭系数 D=1Fv/Fm

11、 吸收光能通过热耗散消耗的部分,1、基础荧光参数 Fo：最小荧光产量，也称初始荧光产量或基础荧光产量 。是对充分暗适应叶片（PS反应中心处于完全开放状态）照以极弱的测量光后发出的荧光。此时光化学猝灭系数qP1，非光化学猝灭系数qNP0。一般认为，这部分荧光是在天线中的激发能尚未被反应中心捕获之前，由天线叶绿素发射出的。 当存在天线热耗散时，Fo会降低；当反应中心失活或遭到破坏时，Fo会升高。已知过高的温度往往使PSII放氧复合体脱离，反应中心失活，此时Fo会明显提高。因此，可以用Fo随温度的变化动态来反映高温对光合器的危害，并用来评价植物的抗热性。,Fm：最大荧光产量(Maximal fluo

12、rescence)， 是PS反应中心完全关闭时的荧光产量。此时光化学和非光化学荧光猝灭均为0 (qP0，qNP0)。 Fm可反映通过PS的电子传递最大潜力。通常叶片经暗适应至少20min后照以饱和脉冲光后测得。 Fs: 稳态荧光产量。即在光照下，光-暗反应达到动态平衡时的荧光产量。,Fm：光适应下最大荧光产量。是在光照条件下照以饱和脉冲光后测得。(此时存在非光化学猝灭，即qNP0；PS反应中心又全部关闭qP0) Fo：光适应下的最小荧光产量。在测定前照射弱远红光(7mmolm-2s-1；l700nm)测得。目的是激活PSI，加速由PSII向PSI的电子传递，产生“基础荧光猝灭”(qo) Fv：

13、暗适应下最大可变荧光 (Fv=Fm-Fo) 。 Fv: 光适应下最大可变荧光 (Fv=Fm-Fo)。,2、荧光猝灭参数 qP =(Fm-Fs)/(Fm-Fo) ：可变荧光的光化学猝灭系数，它反映了PS反应中心的开放程度。 qNP =(Fm-Fm)/(Fm-Fo) ：可变荧光的非光化学猝灭系数。它反映了PS反应中心关闭的程度。 NPQ =(Fm-Fm)/Fm =Fm/Fm-1 ：非光化学猝灭,3、反映PSII光化学效率的荧光参数 Fv/Fm：是重要的荧光参数之一，名称很多，有：最大原初光化学产量；PSII最大潜在量子产量；开放的PSII反应中心量子效率等 ；我们习惯上称其为“PSII最大光化学效

14、率”。其值恒小于1。 Fv/Fm是暗适应下PS反应中心完全开放时的最大光化学效率。反映PS反应中心最大光能转换效率。 Fv/Fo： 是Fv/Fm的另一种表达形式，但从度量上，该指标变化范围大，比Fv/Fm更易区别不同处理间的差别。两个指标的意义基本相同。一般没有必要同时用Fv/Fm和Fv/Fo来表示PSII最大光化学效率。,在非胁迫条件下，Fv/Fm的值很稳定，据Bjorkman and Demmig对大量植物的测定，其平均值为0.832+0.004，但在逆境条件下，Fv/Fm显著降低。正因为如此，所以Fv/Fm的降低常作为发生光抑制或PSII遭受其他伤害的指标。 在一些研究论文中，CO2同化

15、的表观量子效率的降低也常常作为光抑制的指标，但其意义是不同的。,Fv/Fm：光适应下PS最大光化学效率。它反映有热耗散存在时，开放的PS反应中心的光化学效率。 PS=(Fm-Fs)/Fm ： PS实际光化学效率。它反映在照光下PS反应中心部分关闭的情况下的实际光化学效率。 ETR (或Prate) = PS PFDa 0.5 ：表观光合电子传递速率(PFDa为实际吸收的光量子，一般设定为入射PFD的0.84；0.5为假设光能在两个光系统中各分配50%),四. 荧光动力学技术在逆境生理研究中 的应用 叶绿素荧光动力学特性包含着丰富的信息。在理论上，可以用来研究光合作用过程能量吸收、传递与转换的机

16、理。但对于植物生理生态学研究者而言，主要兴趣集中在光合作用的能量利用效率、过剩光能导致的光合作用光抑制、光破坏，以及光破坏防御机制等方面。,Fig.1 Responses of Fv/Fm to chilling treatment and subsequent recovery. Subsequent recovery was conducted under 25 C and 100 mol m-2 s-1 PFD. , chilling treatment under low irradiance; , chilling treatment in the dark. Each point

17、represents the mean SD of 5 measurements on separate leaves.,Fig.2 Effect of chilling treatment (4 C ) under an irradiance of 100 mol m-2 s-1 on the oxidizable P700 in sweet pepper leaves. , chilling treatment under irradiance; , chilling treatment in the dark. Leaves were dark adapted for 15 min pr

18、ior to measurement. Each point represents the mean SD of 3 measurements on separate leaves.,Fig.3 Responses of the relationship between PSII and CO2 and Pn-PFD curves to chilling treatment under irradiance and subsequent recovery. Both chlorophyll a and net photosynthetic rate were measured under 25

19、 C. Subsequent recovery was conducted at 25 C under 100 mol m-2 s-1 PFD. (A) The relationship between PSII and CO2 determined in NA; (B) Pn-PFD curves determined in NA; (C) The relationship between PSII and CO2 determined in LOA; (D) Pn-PFD curves determined in LOA. , CK; , post-treatment; , recover

20、y for 8 hours; , recovery for 32 hours; , recovery for 49 hours.,Fig.4 Responses of the relationship between PSII and CO2 and Pn-PFD curves to chilling treatment in the dark and subsequent recovery. Both chlorophyll fluorescence and the photosynthesis rate were measured at 25 C. Subsequent recovery

21、was conducted at 25 C and 100 mol m-2 s-1 PFD. (A) The relationship between PSII and CO2 determined in NA; (B) Pn-FPD curves determined in NA; (C) The relationship between PSII and CO2 determined in LOA; (D) Pn-PFD curves determined in LOA. , CK; , post-treatment; , recovery for 8 hours.,Fig.1 Effec

22、ts of chilling stress on the maximum photochemical efficiency of PSII (Fv/Fm) of tobacco. Leaf discs were exposed to 100 mol m-2 s-1 PFD at 4 C (, Wild type; , ndhB) and 100 mol m-2 s-1 PFD at 25 C (, Wild type; , ndhB), respectively. Chl fluorescence was measured after 5 min dark adaptation. Each p

23、oint represents the mean SD of 5 measurements on separate leaves.,Fig.3 Time course of the changes in the in vivo PSII-driven electron transport rate (ETR) upon exposure to 100 mol m-2 s-1 PFD at 4 C (, Wild type; , ndhB) and 100 mol m-2 s-1 PFD at 25 C (, Wild type; , ndhB), respectively. Each poin

24、t represents the mean SD of 5 measurements on separate leaves.,Fig.4 Time course of the development of (A) non-photochemical quenching (NPQ) and (B) its fast relaxing component (qf) in tobacco leaves upon exposure to 100 mol m-2 s-1 PFD at 4 C (, Wild type; , ndhB) and 100 mol m-2 s-1 PFD at 25 C (,

25、 Wild type; , ndhB), respectively. Each point represents the mean SD of 5 measurements on separate leaves.,Fig.5 Effects of chilling stress on the formation of zeaxanthin and antheraxanthin at 4 C under 100 mol m-2 s-1 PFD. Controls were treated at 25 C under 100 mol m-2 s-1 PFD. White bar represent

26、s wild type and shadow bar represents ndhB. Each bar represents the mean SD of 5 measurements on separate leaves.,Fig.6 Effects of chilling stress under low irradiance on tobacco P700+. Controls were treated at 25 C under 100 mol m-2 s-1 PFD. Methyl viologen (MV) (2 mM) was vacuum infiltrated after

27、chilling stress immediately and P700+ was measured soon after infiltration. White bar represents wild type and shadow bar represents ndhB. Each bar represents the mean SD of 3 measurements on separate leaves.,五. 误用举例 1. 测定条件选择不当 普遍的问题是暗适应时间不够；特别是存在着持续性的非光化学猝灭，甚至有PSII反应中心破坏的情况下，均使Fm测定值偏低。 因为Fm是PSII反应

28、中心全部开放状态下，照射饱和脉冲光后所产生的最大荧光。 因此，在照射饱和脉冲光之前，必须使PSII反应中心处于完全的氧化态，并且不存在任何非光化学猝灭, 跨类囊体膜的质子动力势应当为0，类囊体膜处于完全的驰豫（放松）状态（relaxation）。 在环境条件适宜的条件下，将叶片暗适应20分钟左右，基本可以达到上述状态；但在胁迫条件下，20分钟显然是不够的。为了得到可靠的 Fm ，较妥当的办法是在黎明前测定一次Fm ，以后的测定和计算均以此值为标准。,但是，当存在着持续性的非光化学猝灭时，即使经过一夜的恢复，Fm也不能达到应有的最大值。这种情况多发生在严重胁迫的条件下，如严重干旱、常绿植物越冬期

29、间等等。此时，由于碳同化及消耗同化力的其它代谢活动受到严重抑制，使同化力大量积累，而且还常伴有PSII反应中心的破坏。 由于在这种情况下不能正确地测出Fm ，因此，利用Fm进行计算的荧光参数，特别是NPQ NPQ =(Fm-Fm)/Fm 会显著偏低。,Idealized diurnal responses of the level of zeaxanthin + antheraxanthin (Z + A), thermal energy dissipation estimated from NPQ,and the level of PS II efficiency predawn and p

30、ost dusk (Fv/Fm) and during exposure to light (Fv/Fm) for leaves of a sclerophytic perennial species in a full sunlight-exposed habitat on a summer day with no additional environmental stress and on a day with stress that prevents photosynthetic utilization of absorbed light or has resulted in down

31、regulation of the capacity for photosynthesis to such an extent that little absorbed light is utilized for photosynthesis.,Idealized traces of Chl fluorescence obtained using a pulse amplitude modulated (PAM) fluorometer.,例1：某作者研究干旱胁迫对刺槐叶绿素荧光动力学的影响 6月30日将各处理浇水至田间最大持水量, 此后停止一切水分供应, 到7月6日部分苗木因干旱而死亡时,结

32、束实验。测定过程中叶片应在叶夹中充分暗适应5min，然后用饱和脉冲方法进行测定。 作者认为：“NPQ由上升转为下降反映了刺槐的光合机构开始遭到破坏”。,保水剂对干旱胁迫下刺槐叶绿素a荧光动力学参数的影响. 西北植物学报，2002,22(5):11441149,例2：昼夜连续测定，需要谨慎。 下图是某作者研究小麦幼苗用PEG进行干旱处理不同时间测得的qP和qNP变化动态. 连续测定42小时, 将受到光合作用昼夜周期的强烈影响. qP和qNP同步下降又同步升高的结果不可信.,例3：测定光强由强到弱的变化过程中荧光参数的变化，应当谨慎。 如某作者研究桑树在PFD由1400到50mmolm-2s-1的

33、变化过程中， PSII、qP和NPQ的变化，结果是 PSII 及qP的增加和NPQ的减少都比PFD由弱变强时变化速度缓慢。并认为：“通过热耗散作用耗散过剩激发能的能力比上午弱”。 实际上，本试验的设计本身就存在问题。因为NPQ的三个组分的暗驰豫时间只有qE最短，半恢复时间在1min左右，而qI的暗驰豫1/2时间可达40分钟以上。如果由强光到弱光，饱和脉冲光的间隔时间仍设计为4min，就连qT的恢复时间都不够，当然测出的恢复就十分微弱。因此这种试验设计的实际意义不大。,用荧光动力学曲线区分过剩光能耗散的不同方式 可将非光化学猝灭qNP区分为三部分： qNPqE+qT+qI qE高能态荧光猝灭 q

34、T与状态转换有关的荧光猝灭 qI 与光抑制有关的荧光猝灭,2. 数据不可信 如，某作者用甲醇处理牡丹后，叶片光合速率提高了53-64，但是光合电子传递速率（ETR）反而下降了5-6.5 本文测定的光合速率光合电子传递速率（ETR）在1.14 - 1.45mmolm-2s-1之间，但光合速率却高达8.30mmolm-2s-1。按理论值计算同化1个CO2至少需要传递4个以上电子，而本文的结果却是每传递一个电子可同化7个以上的CO2！,3. 将荧光参数与作物的丰产性甚至产量直接挂钩，或者将荧光参数作为筛选作物高产品种的重要指标。 要注意：不能将光能转化效率与碳同化速率等同起来（即便是用碳同化速率作为

35、作物丰产性的指标，也是有条件的，并且有很大的局限性）。因为，影响产量的因子很复杂，是由光合性能的五个方面共同决定的，决不仅仅决定于光合速率一个因子。而荧光参数更多地反映光能的转换效率，不能将其等同于光合速率。如：一天中随着上午光强度的提高，光合速率在不断提高，但Fv/Fm却在不断降低。,如：某作者研究干旱对春小麦叶片荧光动力学特征及产量间关系的影响，对水分胁迫下8个小麦品种产量与荧光参数Fv/Fo、Fv/Fm 做相关分析, 结果发现二者关系不显著。这个结果本来应当是预料之中的事。 但作者对前人报道的“不同水稻品种苗期Fv/Fo、Fv/Fm 值均与该品种的产量水平成正相关”的结论似乎深信不疑。反

36、而怀疑自己的结果有什么问题，并且分析了可能的原因，包括 (1) 生长环境不同；(2) 作物不同; (3) 研究时期不同。 并且提出“因本试验所得结论是建立在一年大田试验的基础上, 所以还需在以后继续这方面的研究, 拓宽研究内容”，利用不同试验地、更多小麦品种、在不同生育时期研究叶绿素荧光特征与产量的关系。,4. 对荧光动力学特性和光抑制的基本理论理解有误 例1：某作者研究“桑树叶片PSII对光强日变化的适应特性”时说：“在光合有效辐射逐渐增强时，Fv/Fm和 FPSII降低，非光化学猝灭（NPQ）增加说明引起桑树光抑制的原因除了NPQ之外”。此处将NPQ的增加当作了引起光抑制的原因。 “下午随

37、光强减弱， Fv/Fm和FPSII回升，恢复到接近早晨水平，但是回升的速率比上午下降的速率慢，说明中午PSII活性的降低是PSII可逆失活变化的过程，进一步解释了桑树光合日变化净光合速率中午下降的原因。”,例2：某作者用5 PEG处理溶液培养的水稻，模拟轻度干旱胁迫，结果是PEG处理下，Fo、Fv/Fo和Fv/Fm除个别品种外，均显著下降。由此认为“干旱胁迫下水稻叶片PS活性中心受损”。（干旱胁迫对不同基因型水稻光合特性的影响，干旱地区农业研究，2003，21（3）124126） 应当指出：1、轻度干旱胁迫一般不会导致PSII活性中心的损伤；2、Fo降低，表明不是PS活性中心受损，而是热耗散的

38、增强。,5. 颠倒因果关系： 不分情况，将荧光特性所反映出来的光能利用效率的降低一律当作原因，而将光合速率的降低当作结果。然而，实际上，在绝大多数情况下，是光合碳同化速率的限制，不能及时将激发能利用，导致激发能过剩，而光合机构能够通过各种方式将过剩激发能耗散，从而导致了光能利用效率的降低，并最终反映在荧光参数的变化上。,例1: 某作者发现冷敏感植物辣椒在低温下qP降低而qN上升，于是在讨论中认为：“qN与光合电子传递和光合气体交换无直接关系，仅与ATP和NADPH的形成、累积及光合膜的状态有关”。表明作者对非辐射能量耗散产生的基本原理尚不甚明了。,qN反映了PS反应中心关闭的程度，它与qP之间

39、是互为消长的关系。当光合链上电子传递不畅时，PSII反应中心不能将激发态电子及时传递出去，将通过非光化学猝灭耗散过剩光能，因而使qN增加，qP降低；反之，如果电子传递十分通畅，则qN降低，qP增加。因此qP和qN的消长恰恰是光合链上电子传递通畅与否的反映。 应当强调指出：碳同化同化力的周转光合链上的电子传递PS的氧化还原状态叶绿素荧光猝灭方式是紧密联系的一个完整系统，不可分割开来理解。,例2：某作者研究低温弱光对黄瓜光合与荧光特性的影响，认为： “弱光亚适温胁迫导致电子传递速率的大幅度下降是引起光合速率降低的又一重要原因。” 此处又是将因果关系倒置了。弱光亚适温胁迫后，不论当天还是恢复7天后，Fv/Fm均未发生明显差异，表明PSII的功能并未受到损伤，电子传递速率的下降是对激发态电子利用能力（主要是通过碳同化）的降低造成的。后者是因，前者是果。,又说：“CaCl2通过增强电子传递提高光合速率是其改善黄瓜光合功能的可能机理之一”。 CaCl2不是“通过”增强电子传递来提高光合速率，而是因为光合速率高，才能维持较高的电子传递速率。,例3： 某作者研究盆栽条件下水分胁迫对茶树叶绿素