高效液相简介及常见问题分析.ppt

1、高效液相色谱简介,简介： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用,高效液相色谱简介,特点： 高效液相色谱法有“四高一广”的特点： 1. 高压：流动相为液体，

2、流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压 2. 高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在1530分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时 3. 高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍 4. 高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在L数量级 5. 应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势 6. 柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物 7. 样品量少、容易回收：样品

3、经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备,高效液相色谱简介,此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱,高效液相色谱简介,HPLC仪器的配置及流程：,高效液相色谱简介,色谱分离的机理：,高效液相色谱简介,色谱的图形结果：,高效液相色谱简介,构造：,高效液相色谱简介,高效液相

4、色谱构造： 输液泵：多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，将流动相 源源不断地输送到色谱柱中,高效液相色谱简介,高效液相色谱构造： 色谱柱：常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等,高效液相色谱简介,高效液相色谱构造： 色谱柱：在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图 化学键合固定相应用，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t(R)和半高峰宽W(h/2)，按

5、n=5.54t(R)W(h/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求,高效液相色谱简介,高效液相色谱构造： 检测器：分为紫外检测器和荧光检测器。 紫外检测器：是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器，其工作原理是Lambert-Beer定律，即当一束单色光透过流动池时，若流动相不吸收光，则吸收度A与吸光组分的浓度C和流动池的光径长度L成正比,高效液相色谱简介,高效液相色谱构造： 荧光检测器：是高压液相色谱仪常用的一种检测器。用紫外线照射色谱馏分，当试样组分具有荧光性能时，即

6、可检出,高效液相色谱简介,高效液相色谱构造： 流动相： 1. 溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性 2. 溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长 3. 高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50IOOnm 4. 化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂 5. 低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离

7、.,高效液相色谱简介,HPLC的主要类型： 液一液分配色谱法（LLPC）： 在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物 分离原理：液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分,高效液相色谱简介,HPLC的主要类型： 液一液分配色谱法（LLPC）： 固定相：液液色谱的固定相由载体和固定液组成，通常有以下

8、几类； 1.全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等材料制成，直径约100 m的全多孔型颗粒，这类固定相由于颗粒很细，孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析 2. 表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）：由直径为30 40m的实心玻璃球和厚度约为1 2 m的多孔性外层所组成。目前，这种载体粒度为5 10 m 流动相：根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱,高效液相色谱简介,HPLC的主要类型： 液一液分配色谱法（LLPC）： 正相液-液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定

9、液的极性 反相液-液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性 液-液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失,高效液相色谱简介,HPLC的主要类型： 液一固吸附色谱法(LSAC)： 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的 分离原理：当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时

10、，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附 X + nSad = Xad + nS,高效液相色谱简介,HPLC的主要类型： 液一固吸附色谱法(LSAC)： 固定相：液固吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多 目前最广泛使用的还是510 m的全多孔型微粒填料 流动相：一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极

11、性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂,高效液相色谱简介,HPLC的主要类型： 离子交换色谱法（IEC）： 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广 离子交换原理：离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换,高效液相色谱简介,H

12、PLC的主要类型： 离子交换色谱法（IEC）： 固定相：1. 多孔型离子交换树脂：它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为520m，有微孔型和大孔型之分 2.薄膜型离子交换树脂 ：它是在直径约对30m的固体惰性核上，凝聚12m厚的树脂层 3. 表面多孔型离子交换树脂：它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂 流动相：离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度,高效液相色谱

13、简介,HPLC的主要类型： 离子对色谱法（IPC）： 离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法 分离原理：由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对流水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同,高效液相色谱简介,HPLC的主要类型： 离子对色谱法（IPC）： 固定相：非极性的疏水键合相 流动相：加有平

14、衡离子（反离子）的极性溶液通过改变流动相的pH、平 衡离子的浓度和种类可改变分离的选择性。,高效液相色谱简介,HPLC的主要类型： 空间排阻色谱法（SEC）： 主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的 分离原理：空间排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱,高效液相色谱简介,HPLC的主要类型： 空间排阻色谱法（SEC）： 固定相：排阻色谱固定相种类很

15、多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。 1. 软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中 2.半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大 3. 刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速1cm3s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离,高效液相色谱简

16、介,HPLC的主要类型： 空间排阻色谱法（SEC）： 流动相：排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等,高效液相色谱简介,液相色谱分离类型选择参考表：,高效液相色谱简介,色谱的定量分析： 色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有：,高效液相色谱简介,常见色谱故障： 基线噪音： 检测池脏 检测器灯能量下降 由泵引起的脉冲 检测器上的温度效应 检测池中有气泡通过,高效液相色谱简介,常见色谱故障： 鬼峰： 鬼峰没有进样就有色谱峰出现 原因流动相脏，尤其是水相 双峰： 柱头塌陷或柱床运动