第二章之微生物菌种选育.ppt

1、Contents,菌种的来源,1,发酵高产菌种选育,2,菌种退化和菌种保藏,3,微生物菌种的扩大培养,4,第一节 菌种的来源,细菌,醋酸杆菌,假单胞菌,乳酸菌,Add Your Title,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,棒杆菌、短杆菌,酵母菌,酿酒酵母,异常汉逊氏酵母异常变种,假丝酵母属,Add Your Title,毕赤氏酵母属,汉逊氏酵母属,霉菌,曲霉属,青霉属,根霉属,毛霉属,二、工业微生物来源,source 1,source 2,source 3,向菌种保藏机构索取,从大自然中分离筛选,从发酵制品中分离,三、微生物菌种的选择性分离,微生物样品的采集,微生物样品的富集培养,目的菌种的分离,目的

2、菌的筛选,微生物样品的采集,微生物样品的富集培养,目的菌种的分离,平板划线法,b.,连续划线分离法,分区划线分离法,1.稀释平皿分离法,平板稀释法,100ml,1g,9ml,9ml,9ml,9ml,9ml,9ml,1/100,1/1000,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,(1)稀 释,b.倾注平皿分离法,a.涂布平皿分离法,（2）倒平板,用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株,羧甲基纤维素钠作培养物,抗生素筛选,检定菌培养，加上发酵液,目的菌的筛选,影印平板法筛选目的菌,四、重要工业微生物菌种的分离,筛选菌株的一些重要指标： （1）菌的

3、营养特征 （2）菌的生长温度 （3）菌对所采用的设备和生产过程的适应性 （4）菌的稳定性 （5）菌的产物得率和产物在培养液中的浓度 （6）容易从培养液中回收产物。,生产性能,抗生素产生菌的筛选,Text,抑菌圈法,生长因子产生菌的筛选,产生药理活性化合物菌株的筛选,多糖产生菌的筛选,第二节 发酵高产菌种的选育,菌种改良,遗传基因,一、自然选育,自然选育,在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，选育出优良菌种的过程。,诱变育种,诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产

4、实践或科学研究用。,诱变育种的原理,诱变育种的理论基础是基因突变,紫外线 快中子,NTG NM,噬菌体 转座子,超净工作台,小型X射线衍射仪,Co60射线机,诱变育种的一般步骤,保,放大罐试验，中试考查,大型投产,诱变育种步骤,出发菌株的选择 制备菌悬液 诱变处理 突变菌株的筛选,(一)出发菌株的选择,1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。 2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。 3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。,4出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。 5要尽量选择单

5、倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。,(二)处理菌悬液的制备,这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。,带玻璃珠的三角瓶内,加无菌水,(三)诱变处理,根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,(四) 突变菌株的筛选,筛选分初筛和复筛。 初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。,1) 营养缺陷型的选育,营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些

6、营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。 与营养缺陷型对应的是野生型。,与筛选营养缺陷型有关的三类培养基： 基本培养基（MM，minimal medium）能满足某一菌种的野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。 补充培养基（SM，supplemental medium）在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）的培养基。 完全培养基（CM，complete medium）可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。,筛选营养缺陷型的步骤,诱变 淘汰

7、野生型 检出缺陷型 确定生长谱,一、诱变方法,物理诱变 化学诱变,二、淘汰野生型,抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。 菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。,三、检出缺陷型,原理：利用不同菌株在固体基本培养基（MM）和完全培养基（CM）上，生长情况完全不同的特点。缺陷型菌

8、株在CM上生长良好，而在MM上则不生长，而野生型都能生长。 具体方法：影印法、点种法、夹层法,(一)影印法,此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。,(二)点种法,也就是任意法。 用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。 此法结果明确，但工作量大。,(三)夹层法,先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。 此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不

9、很容易。,四、营养缺陷型的鉴定,验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。,（1）氨基酸、维生素、核酸碱基三大类营养缺陷的鉴定,a-氨基酸混合液 b-维生素混合液 c-核酸水解液,（2）单一氨基酸营养缺陷的确定,将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。个平皿测一个菌。,原理：抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。,方法：选育结构

10、类似物抗性突变株,结构类似物是指一些和微生物体内代谢产物结构相类似的物质，因而能够引起反馈，但是它们不能参与生物合成。,目的：主要用于末端产物的积累,2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株的筛选,在培养基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。 那些对类似物不敏感的突变体，则由于原来受反馈控制的酶的结构，或是酶的合成系统已经发生了改变，它们不再受抑制或阻遏的影响，在类似物充斥的情况下照常能合成该种末端产物。 例如，用类似物D-精氨酸选出的谷氨酸棒杆菌的抗反馈突变株可使L-精氨酸的产量得到提高。,3）抗性突变菌株的筛选,抗生素抗性突

11、变株,在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。,抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。,条件抗性突变,因环境不同，能表现为野生型菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。,温度敏感突变常用于提高代谢产物产量,致死,营养缺陷,抗性突变菌株的筛选方法,一次性筛选法,一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。,噬菌体抗性菌株,耐高温菌株,阶梯性筛选法,梯度平板法,基因突变：,自然选育、诱变育种,基因重组：,杂交、原生质体融合、基因工程,三、杂交育种,标记,标记,亲和力,亲和力,A+ B+ C

12、- D-,A- B- C+ D+,A+ B+ C+ D+,接合,两株E.coli的接合电镜照片,DNA的转化,转导,准性生殖,四、原生质体融合,通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。 原生质体的重组频率已大于1/10，而诱变育种一般仅为百万分之一。,五、基因工程育种,第三节 菌种的退化和菌种的保藏,菌种退化,1,微生物菌种保藏,2,一、菌种退化,是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。,（一）引起菌种退化的原因,基因突变,连续传代,其他因素,（二）菌种的复壮,使衰退的菌种恢复原来优良性状。 狭义的复壮是指在菌种已

13、发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。,菌种的复壮措施,纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。 通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ； 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。采用有效的菌种保藏方法。,1）合理的育种；2）控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错 配率是5x10-4，自

14、发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）；3）选择合适的培养条件；4）采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；5）采用有效的菌种保藏方法。,（三）防止菌种衰退的方法,1. 目的：存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种2. 原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）。,二、菌种保藏,菌 连续在培养基上（内）移种 种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种 保 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液） 法 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上,3.菌种保藏的方法,低温保藏法方法：菌种管置4冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。,干燥保藏法 将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。,真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。 液氮超低