2 植物抗旱生理.ppt

1、,2,第三章 植物抗旱生理,水资源短缺、干旱是一个长期存在的世界性难题，全球干旱、半干旱地区占陆地面积的35，遍及世界60多个国家和地区。作为世界三大粮食产出国的中国、印度和美国，粮食产量占世界的50左右，近几年来出现了严重的水资源危机，从而导致粮食严重减产。 干旱是我国粮食生产的首要灾害，在水资源危机日益严重的今天和未来，开展作物抗旱节水理论与技术研究，具有重大的现实和战略意义。 正如“绿色革命”的功臣、诺贝尔和平奖获得者Borlaug(2000)所说：“我们如何在有限的水资源下，生产更多的食物来满足日益快速增长的人口需要，不可置疑的结论是：人类在21世纪要开展蓝色革命让每一滴水生产出更多的

2、粮食。”,第一节 干旱胁迫下植物的生理变化及适应途径,一、干旱胁迫下植物的生理变化,1、光合作用速率下降,气孔限制 非气孔限制 PSII光化学活性降低 电子传递受阻 Rubisco活性下降 RuBP再生抑制 同化物运输受阻,2、呼吸速率变化：先升后降,原因：氧化磷酸化解偶联 结果：能量供应减少,3、碳水化合物代谢与运输变化,代谢： 淀粉等大分子物质减少，可溶性糖增多 叶中糖增加，茎中糖减少 运输 受抑 加速向繁殖器官运输,4、蛋白质代谢变化,总体变化： 分解合成 证据 同位素标记证明，氨基酸掺入蛋白质减少 多聚核糖体减少 游离氨基酸积累 调节部位 环己亚胺（肽链延长抑制剂）实验证明， 翻译水平

3、调节,5、核酸代谢变化,DNA含量较稳定 RNA含量明显减少,6、激素变化,IAA 干旱促进IAAO活力，降低IAA水平 IAA极性运输受阻 CTK 根尖向地上部运输减少 活性下降 GA 含量减少 ABA含量激增 ETH合成增加（ACC合成酶活性提高）,7、膜脂过氧化加剧,防御酶活性降低 体内抗氧化剂减少 活性氧过量积累,二、植物对干旱胁迫的适应途径,形态结构变化 渗透调节 细胞壁弹性调节 气孔调节 活性氧代谢调节 激素调节,1、叶片大小与厚度 2、比叶重 3、气孔 4、角质层与机械组织 5、超微结构,第二节 植物形态结构与抗旱性,一、叶片,1、根系生长、分布与抗旱性 2、根系形态结构与抗旱性

4、 3、根系伤流与抗旱性,二、根系,第三节 植物在水分胁迫下的渗透调节,水分胁迫：由于干旱缺水对植物正常生理功能 的干扰。 渗透胁迫：环境与生物之间由于渗透势的不平 衡而对植物造成的胁迫。 渗透调节（osmoregulation or osmotic adjustment) 植物在干旱、盐渍等逆境条件下，通过代谢活动增加细胞内的溶质浓度，降低其渗透势，从而降低水势，从外界低水势介质中继续吸水，保持一定膨压，维持正常生理活动。,一、渗透调节的方式和原初机理,1、调节方式 wsp 植物降低s的途径 细胞内水分减少，溶质浓缩 细胞体积变小 通过代谢活动，细胞内溶质主动增加,2、原初机理（Zimmerm

5、ann 机电模型）,水分胁迫 膨压变化 膜收缩或伸展 膜电位变化 机械力转化为电信号 诱导生化反应 增加溶质 渗透调节,二、渗透调节物质的种类和作用,按来源： 外界进入细胞 细胞内合成 按性质： 有机物 无机离子 按积累部位： 液泡型 胞质型,1、无机离子,逆境胁迫下植物积累无机离子的种类和数量因植物的种、品种、器官不同而有差异。 K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cl-、SO42-、NO3-等对渗透调节均有贡献。 中度水分胁迫下，高梁叶片主要积累K+、 Mg2+；向日葵主要积累K+、Ca2+、Mg2+、NO3- 无机离子积累为主动吸收过程 无机离子积累部位：液泡,2、脯氨酸 proline,

6、50年代中期，Kemble等发现，在受旱的黑麦草叶子中，有pro积累，后来发现许多植物都有这种现象：如：barley, wheat, sorghum, soybean, cotton, tobacco, sunflower, cucumber, etc, Stemard后来做了一系列试验，提出了pro作为渗透调节物质的观点，现已被普遍接受。,(1) pro合成的途径,Glu Glu激酶 谷氨酰磷酸 谷氨酰磷酸还原酶 鸟氨酸转氨酶 鸟氨酸转氨酶 谷氨酰半缩醛 鸟氨酸 -酮-氨基戊酸 同步环化 环化 吡咯啉5羧酸（P5C） 吡咯啉羧酸 （PC） pro氧化酶 P5C还原酶 PC还原酶 Pro脱氢酶

7、 Proline,(2)Pro积累原因,Pro合成增加： 标记glu在植物失水后迅速转化为pro。 protein合成受阻： 减少pro向蛋白质掺入。 pro氧化受抑： 干旱时，不仅pro氧化受抑，而且氧化的中间产物发生逆转，再生成pro。这与线粒体膜透性变化有关，其机理是： Pro合成酶位于细胞质，分解酶位于线粒体。在渗透胁迫下，线粒体膜透性发生变化，pro进入线粒体受阻，吡咯啉5羧酸(pro前体)可以从线粒体出来，用于pro合成。,现在已知，在低温、干旱、高温、盐渍、营养不良、微生物感染、大气污染等逆境下，均可引起pro积累，尤其以干旱胁迫下pro积累最为明显，从0.20.7mg/gDW上

8、升到4050mg/gDW,增加了70200倍。 此外，K、ABA可使干旱诱导的pro增加更多更快。,特点： 分子量小：115 溶解度高：162.3g/100gH2O 是一种偶极含氮化合物，生理pH下不带静电荷 对植物无害，600mol.L-1对酶无抑制作用 主要在细胞质中积累（胞质型渗调物质） 作用 保持细胞与环境的渗透平衡，防止水分散失 稳定蛋白质结构（对蛋白质具有稳定其结构的作用） 与细胞内的一些化合物形成聚合物，类似亲水胶体，具有保水作用 作为无毒氮源,（3）pro的特点和作用,3、甜菜碱(betaine),甜菜碱最早是在旱生植物枸杞（Lycium brabraum）中发现的。现在已知有

9、12种，其中最简单、研究最多的是甘氨酸甜菜碱(glycinebetaine)，已在28科、78种植物中检测到，根、茎、叶、花均有分布。如，上世纪70年代中期，Storey等发现，在盐分和水分胁迫下，大麦积累甜菜碱的水平与耐旱性呈正比。,（1）积累特点,Pro:水分胁迫10min即可见积累，复水后很快消失； Betaine:水分胁迫24h才见积累，复水后降解也较缓慢。因其稳定，被认为是持久性的渗调物质。由于稳定，很适合于作为抗旱性选择指标。,（2）生物合成,Ser CDP甘油二酯 CO2 PS 乙醇胺 P-乙醇胺 CDP-乙醇胺 PE CH3 一甲基乙醇胺 P-甲基乙醇胺 CDP-MME P-M

10、ME CH3 二甲基乙醇胺 P-DME CDP-DME PDME CH3 胆碱 P-PC CDP-PC PC 胆碱单加氧酶 甜菜醛 甜菜醛脱氢酶 甜菜碱,(3)特点与作用,特点： 分子量小：117 溶解度高：157g/100gH2O 生理pH下不带静电荷 对细胞无害。0.51mol.L-1高浓度对苹果酸脱氢酶无抑制作用 分布：以细胞质为主（属于胞质型渗调物质） 作用： 维持细胞与环境的渗透平衡，参与渗透调节 参与稳定生物大分子结构与功能 调节离子在细胞中的分布,3、可溶性糖和多元醇,WSC：Sucrose; glucose; fructose; galactose; 游离AA：Asn; Glu

11、; (Pro) 糖醇：甘露醇、松醇、山梨醇 积累原因： 大分子碳水化合物、蛋白质分解加强 光合产物转化方向改变，转向产生蔗糖为主,三、渗透调节的生理功能,1、维持细胞膨压,OA的主要作用，就是全部或部分维持膨压，从而有利于其各种生化反应的进行。 Rice: 在慢速干旱条件下，尽管组织水势下降，但是由于渗调作用，叶片膨压并没变化。,2、保持细胞持续生长,膨压对细胞生长具有关键作用，由于水分胁迫下，通过渗透调节可以维持细胞膨压，因而可以保持细胞在水分胁迫下继续生长。,3、维持气孔开度和光合作用,气孔调节：维持气孔开放，CO2进入细胞 非气孔调节：Rubisco活性 RuBP再生能力 电子传递速率

12、PSII活性 类囊体结构完整性,4、延迟卷叶 5、增加干物质积累,四、渗透调节与抗旱育种,1、OA与作物抗旱性呈显著正相关： 通过corn, sunflower, wheat, barley等为材料研究证明。 2、OA是可遗传性状，由单基因控制 无论是在轻度或严重水分胁迫下，渗调能力强的品种，其产量、收获指数、水分利用效率均高于OA弱的基因型。 3、利用杂交方法，可以产生OA强的品系，表明 OA作为选择指标是可行的。,五、渗透调节基因工程和渗调蛋白研究,1、Genetic engineering of osmotic adjustment,寻找目标基因 首先研究确定参与渗调的关键物质，分析控制

13、这些物质变化的基因。 基因的分离、导入、整合、表达、遗传 渗调基因的应用进展 微生物方面工作较多，也较成功。 高等植物：Kuch等利用羟脯氨酸与脯氨酸的拮抗作用原理，在大麦中获得了高产pro的突变体，突变体叶片中pro含量高于亲本，抗旱性也明显增强。,现已搞清的身条基因有： kdp：在渗透胁迫下，诱导K+吸收和运输，促使K+在细胞内积累。基因表达受渗透势控制。 proU：促进甜菜碱和脯氨酸在细胞内积累，基因表达受渗透势控制。 控制pro合成酶系统的基因： proB: Glu激酶 proA：谷氨酰磷酸还原酶 proC：吡咯啉5羧酸还原酶 bet: 编码betaine合成酶系。,2、渗调蛋白（Os

14、motin）,Osmotin: 在渗透胁迫下产生的、具有增强细胞抗渗透胁迫能力的蛋白质，也叫渗调素。 Osmotin是一种逆境诱导蛋白，早在1962年，人们从果蝇体内发现了热激蛋白，以后在动物、植物、微生物均发现在逆境下，可以诱导产生新的蛋白质，叫做逆境胁迫蛋白。 用NaCl适应的烟草培养细胞系，或受到水分胁迫的番茄培养细胞系，可以新合成一些分子量不同的蛋白质，研究最多的是26kd蛋白。 Singh 胁变b为材料的断裂胁变。 对于不同材料，在弹性胁变区内的弹性性质可能有以下三方面的差别： 产生弹性胁变所要求的最低胁强(f)不同； 弹性模量不同； 能产生弹性胁变的范围或在弹性限度内所能产生的形变

15、的大小(即a值的大小)不同。 对于植物细胞,以上三 方面的性质均与细胞的紧张度的维持有关。,2、细胞的容积弹性模量,杨氏模量仅适用于材料的线性形变，对于植物细胞，在膨压作用下所产生的形变为体积变化，不能简单地套用上式加以处理，于是提出了容积弹性模量(Bulk modulus of elasticity)的概念。并将其定义为: dp dp V V dV/V dv 式中V为容积弹性模量，p为膨压，V为细胞体积，由式中可知，细胞的容积弹性模量就是在膨压作用下细胞每产生单位体积变化所需要的膨压变化。,3、植物组织或器官的容积弹性模量,测量单个细胞的膨压体积关系并由此计算出细胞的V值难度较大。早期工作通

16、过测量在不同浓度溶液中细胞体积的变化间接求得，但很不准确。Green等首次利用压力探针技术实现了大型藻类细胞的膨压测量，但对一般小型细胞则难以实现。 Tyree曾对两者关系进行过理论推导，认为植物器官的容积弹性模量近似地等于各个细胞容积弹性模量的平均值。从植物水分关系与抗旱性的实际应用角度考虑，测量整个叶片的容积弹性模量(v)意义较大，可利用压力室技术进行测量（P-V曲线测定，略）。,三、容积弹性模量的生理意义,v大小可以： 表示植物材料弹性的好坏 反映细胞壁在膨压作用下可进行伸缩范围的大小 不同的植物品种，其细胞壁弹性存在差异。v较小的材料，其弹性较好，在干旱胁迫下相对含水量降低时，膨压下降

17、较慢，可在相当长时间内维持膨压，从而维持其正常生理功能和生长速率。v大的材料则相反。 下图是两个抗旱性不同的大豆品种叶片pRWC关系曲线：,通过比较可见，虽然吸水饱和时小粒豆1号的最大p低于鲁豆4号，但随着RWC下降，小粒豆1号的p下降缓慢，直到RWC降至接近60时膨压才消失；而鲁豆4号的p则随着RWC下降而急剧下降，RWC降至87作用时p即消失。如果将膨压消失点作为萎蔫点，显然，小粒豆1号能在更低的RWC下维持膨压而不至于萎蔫。 从pRWC曲线与横轴的交叉点来看，小粒豆1号的细胞壁的弹性伸缩范围明显大于鲁豆4号。 大豆叶片的不但因品种而异，也因大豆植株所经受的水分胁迫程度而改变。下表为不同水

18、分胁迫条件下两个大豆品种的v(max)。可以看出：分枝期轻度水分胁迫，均能在一定程度上改善叶片的弹性(v降低)，这可能是细胞壁上的生化过程在轻度水分胁迫下进行的主动适应。但严重水分胁迫则使v(max)加大，这有可能是细胞壁在严重干旱条件下硬化所致。在鼓粒期，两品种均失去了降低v的能力。,表1 水分胁迫对两个大豆品种v(max) 的影响 品 种 鲁豆4号 小粒豆1号 水分处理 分枝期 结荚期 分枝期 结荚期 CK 31.4 11.5 13.4 15.3 轻度干旱 17.1 18.7 8.8 18.0 中度干旱 20.1 19.7 9.3 17.3 严重干旱 28.9 24.9 20.2 19.5

19、,由此可见，研究作物叶片的弹性特征对于阐明其抗旱机理具有重要的作用。作物叶片在干旱条件下的弹性调节很可能是除下渗透调节之外又一种重要的干旱话应方式，这种方式在禾本科作物上是否存在尚待研究，但对大豆而言，则弹性调节至少能发挥一定作用。,早期的观点认为，干旱对生长发育得影响，只是水分亏缺对植物得直接损伤效应，而且正是这种损伤效应抑制了细胞得伸长，气孔开度、光合作用等生理过程，从而导致了产量的下降。 但是，近年来越来越多得实验结果显示，在水分亏缺造成各种损伤现象之前，植物就对干旱做出了适应性的调节反应，以便使植物做出最优化选择(optimization)。因此，植物一定具有感知、传递土壤干旱胁迫信号

20、、使之做出快速反应的能力。 目前，国际上对植物逆境信号传递的研究引起了普遍关注。本届简单介绍干旱胁迫下植物如何感知和传递胁迫信号、以及信号的种类、性质和作用机理。,第四节 干旱胁迫下植物根与地上部的信号传递,一、植物根冠通讯信号,（一）信号种类,1、水力信号（hydraulic signals）,hydraulic signal: 由于土壤水分含量的下降引起叶片水分状况（w, s,p, RWC等）变化，进而影响植物的生理功能。 叶片水势是最常用的植物水分状况指标，人们常把w与胁迫程度相联系。Kramer等把土壤干旱对植物的影响解释为： 土壤干旱，水分减少根系吸水减少蒸腾作用存在叶片w下降膨压下

21、降激素合成与运输变化生理功能变化。 可见，这种类型的根冠通讯是靠水的传递来实现的，即水信号传递。 然而，目前又有许多实验证明，在叶片水分状况还没有表现出可检测的变化之前，地上部对土壤干旱的反应已经发生了，从而避免了或推迟了叶片和枝条脱水，以维持正常生长发育。这说明植物根系和地上部之间出了水信号以外，还有其他信号存在。,2、化学信号(chemical signals),chemical signal: 指能够感知和传递土壤干旱信息到地上部反应部位，进而影响植物生长发育的激素或除水以外的其他化学物质。 Bates ,功能蛋白 ： 它们在植物抗逆机制中发挥重要作用 。,这些水分胁迫诱导基因产物不仅通

22、过重要代谢保护细胞结构,而且起调节信号转导和基因表达作用： 通过水分通道蛋白、ATP酶、跨膜受体蛋白、离子通道、有机小分子运载体等膜蛋白加强了细胞与环境的信息交流和物质交换; 通过酶蛋白的作用合成各种渗透保护剂，提高细胞渗透吸水能力; 通过LEA蛋白、渗调蛋白、抗冰冻蛋白、分子伴侣、蛋白酶、热激蛋白等逆境诱导蛋白提高细胞抗脱水能力; 通过SOD. CAT, APX、POD等提高细胞排毒、抗氧化防御能力; 通过蛋白激酶、转录因子、磷脂酶C等调控蛋白提高细胞内信息传递和基因表达能力。,一、水分胁迫诱导蛋白的种类和诱导机制,（一）水分胁迫诱导蛋白的种类和特性,由于分类依据的不同,水分胁迫诱导蛋白被分

23、成不同的类别。 根据对ABA的依赖性,可以将其分为ABA依赖蛋白(RAB)和非ABA依赖蛋白。 根据水分胁迫诱导蛋白在诱导时间上的差别将拟南芥中的水分胁迫诱导蛋白分成两大类:ERD(脱水反应早期蛋白)和RD(脱水反应蛋白)。这是由于拟南芥在遭受干旱胁迫大约2小时后ABA开始大量合成,10小时后达到最高水平,所以将遭受干旱胁迫1小时内诱导的蛋白质称为ERD, 10小时后检测出的诱导蛋白称为RD。一般来说,RD多为RAB蛋白,ERD多为非RAB蛋白。,按其功能不同,又可将水分胁迫诱导蛋白分成两大类: 第一类：在细胞内直接发挥保护作用的功能蛋白。 第二类：参与水分胁迫的信号转导或基因的表达调控,间接

24、对植物起保护作用的调节蛋白。,第一类水分胁迫诱导蛋白主要包括: (功能蛋白）,1、渗调素,这是最早发现的一种水分胁迫诱导蛋白,它们在细胞质中调节和维持细胞的渗透势。其中多数与LEA蛋白,尤其是脱水素(dehydrin)有很大的同源性，一般作为脱水保护剂,帮助细胞保持最小水势并稳定胞质结构。 另外Velaseo(1994)等还从更苏植物中鉴定出了一组特性类似干LEA蛋白、对脱水敏感的基因家族CdeTll24。,2、膜蛋白,在非生物胁迫下首先引起膜透性的改变、膜结构的变化以及发生膜脂的过氧化作用,因此逆境条件下植物诱导合成了许多膜蛋白,以维持细胞膜结构和功能的稳定性。,3、代谢酶类,在水分胁迫条件

25、下,活性氧大量产生并发生异常积累,相应的活性氧清除系统,如超氧化物歧化酶,过氧化物酶等酶系统或维生素E、维生素C、谷胱甘肽、半胱氨酸、类胡萝卜素等非酶系统的活性就会提高,并与自由基反应,清除过量的活性氧,可使机体受到保护以维护细胞的正常结构和代谢。 渗透调节物质合成酶,这些酶的诱导使得渗调物质的合成大大增加。例如脯氨酸合成中的关键酶P5C合成酶(P5CS)以及与ABA合成有关的酶。其次就是一些去氧化酶类如SOD、POD、GST及二氢叶酸还原酶(DFR)等。 与细胞基础代谢途径如糖酵解和卡尔文循环有关的酶如烯醇化酶和磷酸异构酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)、NADP(H)氧化酶以及一个和木质化

26、作用有关的酶也被干旱胁迫所诱导。另外还发现干旱胁迫诱导各种形式的半胱氨酸蛋白酶,以降解干旱胁迫下失活蛋白质。,4、通道蛋白,其中水孔蛋白可以促进水分的长距离运输以及细胞内外的跨膜水运输,还具有调节细胞胀缩等功能。 植物水孔蛋白根据序列同源性可以分为三类: 质膜内在蛋白(PIP) 液泡膜内在蛋白(TIP) NLM蛋白(nodulin 26 like MIPs, NLM),主要分布于两个地方:原生质膜和液泡形成体(tonoplast,即液泡膜)。,5、分子伴侣,在胁迫条件下会导致一些蛋白质变性,而分子伴侣(chaperone)的诱导可以防止蛋白质及膜的进一步变性。,6、运输蛋白,如糖运输蛋白,不仅

27、介导了蔗糖从叶肉细胞外流、韧皮部装载、韧皮部卸出和进入库细胞储藏和利用,据目前的研究结果来看它可能在糖运输和代谢调节的信号转导中还发挥重要的作用。,第二类水分胁迫诱导蛋白主要包括：（调节蛋白),磷脂酶C、磷脂酶D、各种蛋白激酶、G蛋白、钙调素以及转录因子、组蛋白等。 在环境胁迫刺激下,体内这些蛋白质合成增加,通过它们将信号不断传递并放大。,（二）水分胁迫诱导蛋白的诱导机制,水分胁迫诱导蛋白的诱导机制包括三个过程,即水分胁迫信号的感受、转导及最终的基因诱导表达。 在这个过程中,ABA合成增加是对水分胁迫的关键反应,从9顺式新黄质(9cisneoxanthin)或9顺式紫黄质(9cisviolax

28、anthin)到黄质醛(xanthoxin)的氧化裂解是ABA合成的关键步骤,催化该反应的酶是9顺式环氧类胡萝卜素二加氧酶(9cis-epoxycarotenoid, NCED)。 胁迫期间植物体内ABA的浓度以及从根部运输到地上部的ABA大大增多,对水分胁迫信号的转导以及干旱水分胁迫诱导蛋白的表达都起到了很大的作用,大多数的水分胁迫诱导蛋白都可以由外源ABA所诱导。,二、LEA蛋白与植物抗旱性,胚胎发育晚期丰富(late embryogenesis abundant, LEA)蛋白是一种子发育后期产生的一类小分子特异多肽,它是伴随着种子成熟过程而产生的。后来研究认为这类蛋白与植物耐脱水性密切

29、相关,受植物的发育阶段、ABA和脱水信号等调节,在植物的许多组织器官中都有表达。因此LEA蛋白产生机制以及与抗旱性的关系是目前植物抗性生理研究的热点之一。,（一）LEA蛋白的种类、特性与存在部位,根据它们氨基酸序列的同源性及一些特殊的基元序列, LEA蛋白可分为6族: D19 LEA(第1族)、 D11LEA(第2族,又称脱水素)、 D7LEA(第3族)、 D113LEA(第4族)、 D29LEA(第5族)和 D95LEA(第6族)。 后2族为附加族。,（1）第1族LEA蛋白,这族LEA蛋白具有多拷贝串联的20个氨基酸残基组成的保守序列,该序列富含高比例的带电荷氨基酸和甘氨酸,这些氨基酸可占全

30、序列的20%30%。在生理条件下, 70%的多肽可形成随机螺旋、比大多数球蛋白亲水性更强。 棉花Dl9、小麦Em、水萝卜P8B6,胡萝卜EMBl、玉米E564、大麦Bl9,拟南芥LEA等均属第1族LEA蛋白。 在许多植物的基因组中高度保守的第1族LEA基因常以一个基因家族存在, 该家族成员在整个编码区,几乎在20个氨基酸残基组成的基元序列区是高度保守的。但是,不同成员所含基元序列的数目不同。 许多植物都含第1族LEA基因,它与酵母中的这类基因有一定差别。第1族LEA蛋白对胚乳发育和植物生长器官的渗透胁迫有保护的作用。,（2）第2族LEA蛋白,这族LEA蛋白也称脱水素(dehydrin),也是一

31、类亲水性蛋白质,其一级结构特征: 在C端或附近具有富含赖氨酸的基元序列,也称K-片段,K-片段在高等和低等植物中是高度保守的。大约由l5个氨基酸残基(EKKGIMDKIKEKIJPG)组成。K-片段、可磷酸化的丝氨酸残基片段(S-片段)、N端的一些保守序列(Y-片段),以及其他小而保守的重复区域(-片段),拼接形成脱水素,多肽的长度一般为82575个氨基酸残基。脱水素的识别可利用共有Y-片段、S-片段、K-片段,通过PCR技术进行。简称为“YSK速记”。在单个多肽内,K-片段的数量在111个拷贝之间变化。 根据脱水素的结构、第2族LEA蛋白的作用可能有两点: 在植物受到干旱失水时,能够部分替代

32、水分子,保持细胞液处于溶解状态、从而避免细胞结构的塌陷,稳定细胞结构、尤其是膜结构; 起分子伴侣和亲水性溶质的作用,在水分胁迫时稳定和保护蛋白质的结构及功能。,（3） 第3族LEA蛋白,这族LEA蛋白(D7LEA蛋白)通常含有多拷贝的11个氨基酸组成的基元序列(TAQAAKEKAGE)。该组LEA蛋白大小差异很大,所含基元序列的拷贝数少的只有5个(如棉花LEA D7蛋白), 多的则有几十个(油菜LEA 76蛋白有13个重复基元数),大豆cDNA pGmPM8和pGmPM10编码蛋白含有超过30个相连的基元序列。 该组蛋白可依其基元序列的羧基端有无特定的氨基酸延伸区段分为两种类型： 一类是11个

33、氨基酸组成的重复基元序列被与之相似的序列所分离,称第3族LEA蛋白(); 另一类是在羧基末端被特定氨基酸延伸区段的出现而分隔,称第3族LEA蛋白()。 大麦的HVA1与小麦的PMA2005在核苷酸水平和氨基酸水平上均有很高的同源性,分别达91%和95%。这两个单子叶植物的基因与胡萝卜的DC3和棉花的D7关系很密切,均属于第3族LEA蛋白(); 小麦的PMAl949,胡萝卜的DC8和大豆的pGmPM2等属于第3族LEA蛋白()。,在干旱脱水过程中细胞液的离子浓度会迅速升高。高强度的离子浓度造成细胞的不可逆伤害。第3族LEA蛋白中的11个氨基酸残基组成的基元序列可形成兼性-螺旋结构,提供一个具疏水

34、区的亲水表面。螺旋的疏水面可形成同型二聚体。处在亲水表面的带电基团可整合细胞脱水过程中浓缩的离子。如Na+和PO3-4。此外,组成该蛋白的大多数氨基酸残基为碱性。 这些高电荷的氨基酸残基可以重新定向细胞内的水分,束缚盐离子、从而避免干旱胁迫时细胞内高浓度离子的累积所引起的损伤、同时也可防止组织过度脱水。,目前,在多种植物中都有关于第3族LEA蛋白或基因的研究报道。有人认为这些基因的表达或蛋白累积与植物的渗透胁迫抗性正相关。 例如,在严重干旱的小麦幼苗中,第3族LEA蛋白累积量的大小与组织的耐旱能力密切相关。 此外。脱水还可造成Lea mRNA,包括第3族Lea mRNA转录水平的增加。在所有已

35、知的第3族LEA蛋白中,对大麦的第3族LEA蛋白HVAl的研究较多。HVAl基因在开花后25天,开始在种子糊粉层和胚中高水平表达、而在淀粉质的胚乳细胞中却检测不到HVAl mRNA及相关蛋白。但可被干旱等环境胁迫和ABA诱导表达。如萌芽3天的大麦幼苗经0.l mmolL-1 ABA或干旱处理后,幼苗的所有器官中均有高水平的HVAl mRNA和蛋白质出现。 Duan等(1996)将HVA1 cDNA全序列导入水稻,获得了抗旱、抗盐的转基因水稻,直接证实了第3族LEA基因可能具有干旱保护功能。 但也有相反报道,如从耐脱水更苏植物Craterostigma plantagineunz分离出一个第3族

36、LEA基因PcC3-06,将其转到烟草中高效表达。但转基因烟草在抗旱性方面并没有得到提高。 因此对于第3族LEA蛋白的详细功能及其在细胞中的生理作用还有待进一步的深入研究。,（4） 第4族LEA蛋白,棉花lea 14、D113和更苏植物Craterostigma PGC2745P属于第4族LEA蛋白, N端氨基酸序列形成兼性螺旋,C端序列保守性较差,呈无规则结构，在膜结构中可能形成一种保护结构,或起束缚离子的作用,植物脱水时可保持膜稳定性,以代替水的作用。,（5） 第5族LEA蛋白,第5族D29 LEA蛋白,也含有重复的11个氨基酸序列,与3族D7的序列相比,每个氨基酸化学性质相似,只是每个残

37、基位置缺乏高度专一性,这一族蛋白在植物缺水期间有富集离子的作用。 LEA蛋白是一类亲水性大家族,尽管分为不同的族,但它们有共同的特点,都是由极性氨基酸组成,是亲水性的多肽,甘氨酸含量6%, 亲水指数1.03,具有高度的亲水性。 LEA蛋白除了在干旱胁迫中发挥作用之外,寒冷、盐胁迫也同样诱导LEA基因表达及LEA蛋白积累。 如将番茄lea25基因导入酿酒酵母能提高其抗寒能力。小球藻的C27品系在冷锻炼过程中产生的低温诱导蛋白HiC6。该蛋白与甘蓝型油菜的第3族LEA蛋白lea76具同源性。这些研究表明,LEA蛋白在植物耐寒、耐盐性方面也发挥重要作用。,（二）LEA蛋白的功能与抗旱性,LEA蛋白最

38、大的物理化学特性是具有很高的亲水性和热稳定性,即使在煮沸条件下也能保持水溶状态。研究表明,植物在水分胁迫时面临的最主要问题是细胞组成成分的晶体化,这将破坏细胞的有序结构。而LEA蛋白具有高度的亲水性,能把足够的水分捕获到细胞内,从而保护细胞免受水分胁迫的伤害。 LEA蛋白的另一个特点是,它们中的有些成员可被ABA和水分胁迫因子诱导产生, 有时二者的作用可相互代替。如未发育成熟的小麦胚在体外培养时并不累积LEA蛋白,但若在培养基中加入ABA或施加渗透胁迫条件,则可诱导LEA蛋白的产生。 植物严重脱水受害是由于水分损失导致细胞结构凝结,受到细胞膜结构伤害之故,而LEA蛋白则能够削弱这种伤害。在干旱

39、环境下,多数植物能诱导LEA蛋白,但LEA蛋白的抗旱机制仍然不清楚。,Swire和Marcotle(1999)用酵母菌试验模型系统,研究小麦第1族LEA蛋白中Em蛋白功能,认为该蛋白在酵母中对细胞膜有渗透保护作用,在正常渗透浓度下,酵母细胞Em蛋白的表达对生长无害,但在高渗透浓度下,能够抑制或减慢生长,促进各种渗透调节物质的积累。由于第1族LEA蛋白含有大量极性氨基酸和无序(无盘旋)结构, 它能吸附大量束缚水,因而对胚乳和植物生长组织的渗透胁迫有保护作用,这是用酵母表达系统通过结构功能研究第1族LEA蛋白对渗透保护机制的第一个生化证据。 Zhang(2000)等用酵母异质表达系统研究水分胁迫下

40、LEA蛋白对细胞代谢的作用,他们先向该系统转入两个lea基因,即番茄lea4(2族)和大麦HVAl(3族),在GALl启动子的作用下进行表达,用特异抗病毒检测这些基因产物。结杲发现:当转入1.2molL-1 NaCl介质时,HVAl基因在酵母细胞中提前表达,但不促进基因的表达;当转入1.2 molL-1KCl介质时, lea4和HVAl基因在细胞中均表达,以致生长减慢;在高山梨糖醇介质中,这两种基因没有明显变化。若细胞含有这两个lea基因,抗冻性就会增加,而抗热性则无变化,说明LEA蛋白对保护细胞质脱水有着特殊作用。尽管人们对LEA蛋白作了大量研究,但迄今有关各族LEA蛋白的确切功能还不清楚,

41、只能根据其氨基酸序列和预测的蛋白质结构进行推断。,(三)LEA蛋白序列结构与其抗旱性,根据LEA蛋白序列结构特殊性,Baker(1988)等提出一种假设,认为D29 LEA蛋白(也存在于D7LEA中)含有由11个氨基酸组成的重复基元序列,即T/A、A/T、O/E、A/T、A/T、K/R、Q/ED、K/R、A/T、X、ED/Q,此种序列形成的氨基酸盐桥,可充实蛋白质结构,提高细胞液中的离子强度,从而抵抗或减轻干旱引起的伤害。这类重复元件多数存在于-螺旋结构中,疏水和亲水氨基酸位于此螺旋中的特定部位,在其分子内部可能形成维管束,表层有结合阴阳离子的功能。,LEA蛋白有较高亲水性,不仅有序列特异性,

42、空间结构也有特点。在水分缺乏时,此种蛋白在细胞中像可溶性糖的作用一样,有增强束缚水的作用。 Baker等(1988)报道,缺水条件下,D13和D11 LEA蛋白能“溶解”在细胞质的结构中,其结构的卷曲部分,能形成适应其他结构的形状,此结构与水产生的结合力比糖形成的稳定性强,至少在晶体保护上比蔗糖好。McCubbin和Kay(1985)发现小麦Em蛋白(D19)亲水性比多数球蛋白多肽强,在生理条件下, 70%以上肽链处于无规则卷曲状态,植物缺水时,这些特殊结构有束缚水分子的作用。尽管D13 LEA蛋白在长螺旋结构N端无亲水性,但在无规则卷曲的尾部则有较强束水作用。,三、水孔蛋白与植物抗旱性,所谓

43、水通道即存在于哺乳动物和植物细胞膜及微生物中转运水的特异孔道, 该孔道是由一系列具有同源性的内在膜蛋白家族成员所形成,称为水通道蛋白或水孔蛋白(aquaporin, AQP)。 植物水孔蛋白在植物体内形成水选择性运输通道,在植物种子萌发、细胞伸长、气孔运动、受精等过程中调节水分的快速跨膜运输。 有些水孔蛋白还在植物逆境应答中起着重要作用,因此研究水孔蛋白与植物抗旱性的关系引起了广泛关注。,（一）植物水孔蛋白的发现,水是生命之源,细胞内外水分平衡的稳定是维持生命的关键因素之一。但水通过细胞膜的机制一直是个谜,所有组织细胞膜都允许水以简单扩散的方式通过, 后来注意到动植物的一些器官、组织具有独特的

44、水分运转能力,例如动物的红细胞和肾上皮细胞,它们运输水分的速度非常快,人的肾脏细胞平均每昼夜要过滤180L的水,动物的肾小球集合小管在抗利尿激素的作用下,对水的通透性可在几秒钟内发生从低到高的急剧变化;植物在种子萌发及花粉管伸长时伴随着由体积增大而发生的水分快速吸收,这些都不能以水穿越膜脂质双分子层弥散来解释,故形成了在某些组织中可能存在功能性水通道的假说。 Macey(1984)第一个证明了对氯汞苯磺酸(p-chloromercuribenzene sulfonete, PCMBS)对红细胞膜水通透性具有强烈抑制作用。进一步研究证明, PCMBS对尿素的通透性无影响。这种水通道与溶质通道明显

45、相互独立的状态表明,有水选择性通道蛋白的存在。,1988年Agre等在鉴定人类Rb血型抗原时,偶然在红细胞膜上发现了一种新的跨膜蛋白。此种蛋白既可以以非糖基化的28kDa多肽的形式存在,也可以是一条迁移至4060kDa的N-糖基化带,两者的比例大约为3:1。氨基酸测序发现28kDa蛋白和眼晶状体主体内在蛋白MIP26是同系物,因此有了暂用名“CHIP”(channel-like integral membrane protein)。19911992年,Agre及其同事又先后完成了该蛋白的分子克隆和功能鉴定,证实该蛋白具有水通道功能,从而确认了细胞膜上存在转运水的水通道蛋白的理论。1997年被基

46、因组命名委员会重命名为AQPl。 AQPl的发现,掀起了人们分离、鉴定水孔蛋白(亦称水通道蛋白)的高潮。短短几年内,人们巳在细菌、酵母、动物、植物中分离出许多水孔蛋白同源基因。在植物中第一个水孔蛋白r-TIP是由Maure等(1993)从拟南芥中分离出来的。r-TIP的cRNA在爪赡卵母细胞中的异源表达,证明它具有水分运输特性,属于植物水孔蛋白中的液泡膜内在蛋白(tonoplast-membrane intrinsic protein,TIP)。植物质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic protein, PIP)也是在拟南芥中首次发现的, Kammerloher等(

47、1994)用拟南芥根质膜内在总蛋白产生的多克隆抗血清来免疫筛选拟南芥根cDNA文库，得到了几个阳性克隆，经鉴定为植物质膜水孔蛋白。,水孔蛋白与1984年Gorin等从牛晶体纤维(bovine lens fiber)细胞膜中分离到的跨膜通道主嵌入蛋白(major intrinsic protein, MlP)基因具有很高的序列同源性和结构相似性,因此将它们同归于MIP家族,分子质量在2629kDa之间, 在生物膜中形成水通道并协助水分跨膜运输的膜内在蛋白。绝大多数水孔蛋白形成水的选择性通道,但也有一些水孔蛋白同时也可运输小分子中性亲水溶质。,（二）植物水孔蛋白的种类,植物水孔蛋白根据序列同源性可

48、以分为三类: PIP (质膜内在蛋白) TIP(液泡膜内在蛋白) NLM蛋白(nodulin 26 like MIPs, NLM)。,PIP主要分布在细胞质膜上,Kammerlober等(1994)以拟南芥质膜内蛋白的抗体为探针,运用哺乳动物眼细胞表达体系,从拟南芥的cDNA文库中筛选了5个MD相关蛋白。它们普遍存在于根、茎、叶及果实质膜上,因此称为PIP, PIP可再分为PIP1, PIP2和PIP3三类。 Robinson等(1996)运用免疫定位实验发现拟南芥叶肉细胞质膜上PD1主要聚集在一种被称为质膜体(plasmalemmassome)特殊结构域,在这些区域质膜和液泡膜彼此接触,从而

49、加快了液泡与质外体之间的水分交换。 PIP与TIP之间的氨基酸同源性较低(约50%左右),而且PIP较TIP具有较长的N端。在PIP中,PIP1和PIP2的区别在于N端和C端的不同, PIP1比PIP2具有较长的N端和较短的C端,而且在序列当中各有相应的保守氨基酸。Daniels等(1994)发现原先鉴别的干旱胁迫蛋白RD28也具有水通道活性, RD28与PIP2b具有高度同源性,它们的氨基酸序列及cDNA序列有92%同源性。,TIP (tonoplast intrinsic protein)主要分布在细胞液泡膜上。TIP可再分为、-TIP等4类,它们的cDNA在爪赡卵细胞中异源表达时,未发现

50、它们运输水分以外的小分子。Hofte等(1992)研究发现拟南芥不同细胞的液泡膜存在着两种不同的TIP：-TIP和-TIP。-TIP主要存在于种子液泡膜上,-TIP则位于除种子以外的所有营养体器官的液泡膜上,-TIP和-TlP之间的氨基酸序列有58%同源性。-TIP、-TIP与菜豆种子液泡膜上TIP的同源性分别为68%和58%。运用Gus融合基因技术发现-TIP在不同植物组织中表达模式很不一样,其表达仅局限于顶端分生组织后很窄的区带,亦即TIP表达与细胞液泡化同步。TIP的分子质量比PIP和NLM的分子质量小,而且等电点分析表明,TIP的酸性比PIP和NLM的酸性大,这主要是由于PIP和NLM

51、的C端区域的碱性较强。,NLM蛋白中除了NOD26(nodulin26)已知分布在细菌与植物的共生膜上外,其他成员在细胞中的定位未知。NOD26是植物中第一个发现的MIP家族成员,它由271个氨基酸残基组成,负责植物细胞与细菌之间小分子物质的转运。Roberts等(1997)发现爪蟾卵母细胞中表达的NOD26具有汞敏感的水通道活性,除运输水分以外,对甘油、甲酰胺等不带电的溶质分子也具有较高的通透性。NLM在分子质量与等电点上同PIP较为相似,但对其成员了解较少。,（三）植物水孔蛋白的结构,水孔蛋白的结构都具有MIP家族结构的典型特征。HgCl2 对水孔蛋白功能的抑制发生在Cys残基上,且往往与

52、NPA保守序列相邻的Cys。在CHIP28中, Hg+的抑制位点是Cys189,但Cys189对CHIP28的功能并不是必需的,它仅是Hg+敏感位点。这巳从存在Hg+不敏感型水孔蛋白得到证实,如植物质膜上的水孔蛋白RD28就是Hg+不敏感型的,它的NPA序列附近没有cys残基。Walz等证明,虽然CHIP28单体可形成独立的水通道,但其结构的稳定和功能的正确行使,则需要蛋白在膜上的四级组装。膜冰冻蚀刻(freeze-fracture)技术观察发现,4个CHIP28亚单位组成一个跨膜结构。,AQP1的每个亚单位共跨膜6次,并在胞内外形成5个环(A、B、C、D、E)。A、C、E环位于胞外,B、D环

53、及氨基和羟基末端位于胞内。,AQP1一个亚单位的“沙漏”模型,A,B,C,D,E,值得注意的是Jung等(1994)提出的“沙漏”模型(the hourglass model,图)。“沙漏”模型在保持水孔蛋白两个重复单元对称性的前提下,依据B和E环都为典型的疏水结构,使两环分别从膜两侧埋入膜内。通过分子的折叠, B和E环形成一狭窄的水孔道。CHIP28中汞敏感位点,即E环的Cys189和可能存在于B环的Cys73就位于水孔道的上下方。 然而,结构上的分析尚不能说明水孔蛋白的选择性。Macey(1984)推算水通道的直径应大于1.5A(水分子直径)、小于2.0A(最小可通透溶质,如尿素的直径)。

54、尽管“沙漏”模型中分子折叠形成的孔道,可以从孔径大小上说明尿素不能通过水孔蛋白,但是还无法反映水孔蛋白不选择离子或H3O+这一特性。,(四）植物水孔蛋白的存在部位,在植物细胞内,水孔蛋白主要分布在原生质膜和液泡形成体(tonoplast,即液泡膜)。 水孔蛋白的表达具有时空特异性,在有水分大量流动的组织和器官中水孔蛋白的表达很高,如根表皮、外皮层和内皮层细胞、靠近木质部导管的木薄壁细胞、韧皮部伴胞、保卫细胞以及在植物发育的特定阶段,如种子萌发、细胞伸长、花粉管伸长、维管形成等时期,某些水孔蛋白的表达异常丰富。 例如:拟南芥-TIP在种子储藏囊泡中特异表达; NOD26只在大豆根瘤中细菌与植物共

55、生膜中表达;烟草的TobRB7在根柱中表达;而烟草的NtAQP1在根中靠近维管组织的细胞表达;向日葵的Sun TIP-7和SunTIP-20均在保卫细胞中表达; 冰草的MIP-A在根的分生组织及木薄壁细胞中表达;拟南芥的PIPb和-TIP、玉米的TIP及油菜的BobTIP26-1、Bn-TlP等均有报道表明它们参与细胞的伸长与分化。水分是在水势梯度的驱动下由水孔蛋白被动运输的,植物通过改变水孔蛋白的丰度或水孔蛋白的状态来控制水的流入或流出。,（五）植物水孔蛋白的功能,1、在种子成熟和萌发过程中的作用,种子储藏薄壁细胞的液泡具有许多特定功能,并与蛋白储藏、裂解、运输以及代谢相适应。而水孔蛋白TI

56、P在种子成熟过程中大量积累,故认为其在种子成熟与萌发中起着重要的作用。在种子成熟过程中大量的储藏蛋白合成,种子内形成了数以万计的蛋白储藏囊泡(PSVs)。在种子萌发过程中,种子迅速吸水,液泡膜的流动性增强,伴随着蛋白储藏囊泡中的储藏物质分解,溶质从储藏囊泡中释放出来,后期液泡又融合形成大的中央细胞。细胞质渗透系统剧变,种子需要迅速进行的新的渗透平衡。TIP的存在使水快速出入液泡以保证细胞能迅速膨胀和紧缩。Johnson和Hofte(1990)等研究表明,TIP在种子成熟晚期积累,在种子萌发及幼苗初期消失,取代它的是另外一种水孔蛋白TIP,与幼苗初期细胞的伸长有关。,2、在水分运输过程中的作用,

57、AQP对水既有专一性，负责水分的跨膜快速流动，具有严格的选择性。经HgCl2处理后可抑制水分透性90%以上。 Netting等(2000)发现,水分是目前发现的胞内唯一中性小分子; AQP的跨膜通道内侧分布着疏水氨基酸残基,赋予AQP水分运输高效性,AQP对水分的选择是由于跨膜通道直径仅有3 A , 这就限制了其他物质的透过;在跨膜通道内部NPA的基序中,Asn76, Asn192两个残基向内部突出,因而通道收缩,当水分以单分子链穿过通道时,这两个残基与水分子间形成氢键,于是水分子之间的氢键被打断,从而形成一道排斥离子而仅允许中性溶质通过的高度非介质屏障,此时质子不能被传递。,在植物中,水分的

58、长途纵向运输主要在韧皮部筛管和木质部导管(或管胞)中进行。在根系,内皮层细胞壁上的凯氏带对水分运输形成障碍,意味着在根的皮层或内皮层,质外体水分流动必须进入共质体,在拟南芥中,PIP1水孔蛋白在根内皮层中的表达高于在根皮层中的表达证实了这一点。木质部薄壁细胞也是水孔蛋白高度表达的地方,在控制水分的渗透和水压运动过程中起着重要的作用。 Steudle和Boyer(1985)提出,水从木质部流出的速度由导管周围的小细胞决定。由此可以设想,维管束细胞中-TIP的表达和RD28的诱导应比其他细胞高。Ludevid等(1992)用报告基因研究启动子证实了-TIP在维管束中的表达高于薄壁组织及皮层细胞。,3、在植物渗透调节中的作用,许多植物细胞具有高度的液泡膜水分渗透性。液泡膜上的水孔蛋白可减少对跨细胞水分运输的液泡阻力。 Kiyosawa和Tasawa(1977)发现轮藻细胞的液泡膜对水通透性比质膜更高;在烟草悬浮培养细胞和洋葱表皮细胞中,液泡膜的渗透性为原生质膜渗透比的100倍。表明水孔蛋白在液泡膜的水分运输方面具有渗透调节作用。,在成熟细胞中,原