逆转录酶的发现.ppt

1、逆转录酶的发现,目录,一. 科学史 二. 发现逆转录酶的背景 三. 证明逆转录酶的存在 四. 逆转录酶的生物学意义,科学史,逆转录酶是1970年美国科学家Howard Temin和David Baltimore分别于动物致癌RNA病毒中发现的，他们并因此获得1975年度诺贝尔生理学或医学奖。,1958 年, 坦明开始对RN A 肿瘤病毒 (R S V ) 的研究 。 R S V 属RN A 病毒 。 坦明发现, R S V的行为不同于DN A 病毒, 也不同于一般的RN A 病毒 。 大多数病毒与细胞分裂是对抗性的 。当把病毒加到单层细胞培养物上时, 病毒与细胞的相互作用, 常导致感染细胞的死

2、亡 。 而感染了 R S V 的雏鸡细胞, 非但存活下来, 而且转化成能继续分裂并且产生新病毒颗粒的癌细胞 。 感染 R S V 大鼠细胞转化成了能分裂的癌细胞, 但不产生新的病毒颗粒 。当把转化了的大鼠细胞与正常的雏鸡细胞融合时, 可以诱发R S V 颗粒的形成 。坦明利用放线菌素D 所做的实验解释了这种现象 。,发现逆转录酶的背景,Crick最初设想的中心法则, 并没有排除遗传信息由RNA向DNA的逆向传递 。但当时绝大多数生物学家都认为, 自然界的生物体并不需要这种逆向传递。然而, 通过 1960 到1970 这十年的研究, Howard Temin和David Baltimore等发现

3、并证实了反转录酶的存在 。,放线菌素D 能抑制以DN A 为模板的 RN A 合成, 但不影响以 RN A 为模板的 RN A 合成 。 坦明把放线菌素D 加到形成 R S V 的细胞培养物中, 发现全部的 RN A 合成都受到了抑制 。他认为, R S V 可能是通过一种DN A 中间物进行复制的, 即当 R S V 感染细胞以后, 可以其 RN A 为模板合成相应的 DN A 分子, 该 DN A 分子整合到细胞的 DN A 分子中, 随细胞DN A 的复制而复制, 并不呈现感染性 。 当受到某种激活时, 又能以有感染性的病毒颗粒的形式重新出现 。这就是 “ 原病毒假说” 。它的提出, 使

4、人们认识到逆转录现象的存在 。1970 年,坦明和水谷哲 (S A TO SH I M i zu tan i ) 在实验中发现, R S V 的病毒粒子含有一种能把单股病毒 RN A 转录到DN A 上去的酶 。与此同时, 巴梯摩尔独立地用小白鼠败血病病毒为材料, 也发现了同样的现象 。 他们的文章一同发表在 1970 年 6 月 27 日的 自然 杂志上, 使逆转录现象得到了公认 。 这样, 中心法则就修正成所示的形式如图,正常的雏鸡细胞,正常的雏鸡细胞,正常的雏鸡细胞,前病毒假说,1970 年,坦明和水谷哲 (S A TO SH I M i zu tan i ) 在实验中发现, R S V

5、 的病毒粒子含有一种能把单股病毒 RN A 转录到DN A 上去的酶 。与此同时, 巴梯摩尔独立地用小白鼠败血病病毒为材料, 也发现了同样的现象 。 他们的文章一同发表在 1970 年 6 月 27 日的 自然 杂志上, 使逆转录现象得到了公认 。,证明逆转录酶的存在,Can a retrovirus perform DNA synthesis? 反转录病毒进行DNA的合成？,实验步骤,各组加入放射性标记的脱氧胸苷三磷酸（dTTP的），连同其他三个脱氧核苷三磷酸（的dATP，dCTP，dGTP）到病毒颗粒的准备物中，并寻找掺入到DNA的放射性dTTP。事实上，在每个实验中，放射性标记的dTTP

6、都被并入核酸。,当Baltimore加了放射性标记的核苷酸三磷酸（的rNTP）和其他三个核糖核苷三磷酸来破坏病毒时，他可能没有检测到RNA的合成。 为了证明所形成的产物实际上是DNA，用特异性酶降解或RNA（核糖核酸酶，或RNA酶）或DNA（脱氧核糖核酸酶，或脱氧核糖核酸酶）。他们发现产物是唯一的，只对DNA酶敏感。这些简单的实验，总结在上表中的结果表明，在颗粒中的一种酶能合成DNA。,模板是什么？,Baltimor和Temin用RNA酶处理预培养的病毒粒子，它催化RNA降解成单磷酸核糖核苷酸（rNMPs）。如果RNA是真正的模板，在模板降解后，会阻止由病毒颗粒制剂使DNA合成。事实上，这是事

7、实。 用RNA酶预处理病毒粒子的时间越长，DNA合成活性越低，从而证明在病毒体的一种酶能催化RNA-依赖性的DNA合成。,逆转录酶的生物学意义,今天已经弄清楚逆转录酶催化的合成机理和反应进行所需的各种条件。同时也证明了在逆转录酶和内源所组成的反应系统中, 初期合成的产物为RNA-DNA杂交分子, 反应延长时出现单链和双链。分子杂交实验证明, 所合成的为模板的拷贝。逆转录酶具有双重功能, 一方面它可以利用病毒RNA为模板在其上合成出一条互补DNA链形成RNA-DNA 杂交分子，另一方面, 它又以新形成的 DNA链为模板, 合成出另一条互补DNA 链, 形成双链分子。另外, 它还能专门水解RNA-DNA杂交分子中的RNA。既然逆转录现象存在于所有致癌 RNA病毒中, 那么可以想见, 它的功能可能与病毒的恶性转化有关。如果能找到这类酶的专一性抑制剂, 就可以不损害健康细胞而达到治疗肿瘤的目的。,RNA的自我复制和逆转录过程，在病毒单独存在时是不能进行的，只有寄生到寄主细胞中后才发生。逆转录酶在基因工程中是一种很重要的酶，它能以已知的mRNA为模板合成目的基因。在基因工程中是获得目的基因的重要手段。 以DNA为模板合成RNA是生物界RNA合成的主要方式，但有些生物像某些病毒，噬菌体它们的遗传信息贮存在RNA分子中，当它们进入宿细胞后，靠复制而传代，它们在RNA指导的RNA聚合酶催