单克隆抗体的制备ppt课件.ppt

1、丁乔棋 2015年8月9号,单克隆抗体的制备 Monocolonal antibody,1,什么是单克隆抗体？,1、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）： 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单克隆抗体。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。,Page 2,单克隆抗体制备原理,-,-,-,-,-,Page 3,单克隆抗体杂交瘤技术基本流程,Page 4,在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！,3种杂交细胞：B-B融合细胞、杂交瘤细胞 瘤-瘤融合细胞 未融合的

2、细胞：单个的B细胞、单个的骨髓瘤细胞,这五种细胞中， 没有分裂能力，逐渐衰老死亡； 的DNA复制只有D途径， 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡， 但的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但是还可以通过 S 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。,Page 5,Page 6,单克隆抗体的制备步骤,一：免疫原的制备 ： 1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质 2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质 3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体,Pag

3、e 7,单克隆抗体的制备步骤,免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的Bal B/C。 免疫原：细胞性抗原：（12）107/只，不加佐剂，23周重复一次 可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，36周 100200微克抗原，融合前3天，加强免疫。 免疫程序： 免疫剂量、免疫途径、免疫次数、 间隔时间、佐剂的选择。,二.动物免疫,Page 8,单克隆抗体的制备步骤,抗原接种,Page 9,单克隆抗体的制备步骤 三：细胞融合细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤细胞继承了 B淋

4、巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制奠定了坚实的基础。,Page 10,所需试剂：培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液 细胞融合剂：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而 有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度 与毒性有所不同,Page 11,单克隆抗体的制备步骤,三.细胞融合 步骤, 1：饲养细胞为小鼠的腹腔巨噬细胞。,Page 12,单克隆抗体的制备步

5、骤,1： 将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀 2： 离心，弃上清，磨成糊状 3：将离心管置于37温水，摇动；边滴加PEG1450 4：加入DM液 5：离心，弃上清 6：HAT 重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱 7：五天后，15%血清的HAT补液 8：八天后，彻底换15%血清DM液,三.细胞融合,Page 13,ELISA方法筛选阳性孔,单克隆抗体的制备步骤,四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选,Page 14,阳性孔,单克隆抗体的制备步骤,用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测呈阳性反应,四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选,间接ELISA方法筛选阳性孔

6、,15,单克隆抗体的制备步骤 六：亚克隆 是为了获得稳定的阳性菌株 对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失,16,单克隆抗体的制备步骤,筛选阳性细胞孔 HAT重悬阳性孔内的细胞 取10ul做倍比稀释 目标孔：80-100个细胞 将目标孔细胞全部移至适量的HAT溶液中，铺板 每次亚克隆十天后，用ELISA法做抗体检测，确定阳性孔 按上述方法进行第二，第三次亚克隆 第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔的细胞进行扩大培养,六：亚克隆,每次亚克隆后要进行细胞的冻存保

7、种,Page 17,单克隆抗体的制备步骤,1：在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细 胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故。 2:配制方案：DMEM:血清：DMSO=7：2：1 “慢冻”：分步冷冻，30-70液氮保存数年至数十年. “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、复 苏.,七：杂交瘤细胞的冻存与复苏,细胞冷冻的意义 防止污染 、 避免染色体丢失、防止非分泌细胞的过度生长、防止细胞密度过高而死亡,Page 18,单克隆抗体的制备步骤,八：如何得到大量的单克隆抗体？,动物体内诱生法：

8、使用的动物当然首选BALB/c小鼠 ,将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。,体外培养法： a、悬浮培养法 b、微载体培养法Microcarrier c、中空纤维细胞培养系统 d、微囊化细胞培养系统,Page 19,收集细胞培养瓶中的杂交瘤细胞以备注入小鼠腹腔诱生腹水时,一定要用 无血清培养液多离心几次,将细胞培养液含有的牛血清洗净,防止牛血清进入 了小鼠腹腔使小鼠死亡。小鼠的选择上一定要选择活力好、腹腔大的小鼠。当 小鼠腹腔开始发胀后,每天密切关注小鼠状态,取出腹水,立即离心,去除上层的腹腔脂肪,下层有时会出现细胞,除去。

9、离心后马上进行纯化。,Page 20,单克隆抗体的制备步骤,饱和硫酸铵一DEAE离子交换柱法 离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离,而后流经固定相,使之与固定相上的可解离基团进行离子交换,吸附于固定相上,凡不能进行交换吸附的成分,则流出层析柱外。当pH一7.4时,IgG所带电荷为零,最先流出柱子。过柱前先用饱和硫酸铵法初步提纯。蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同,血清丫球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀,而白蛋白则不易沉淀,据此可将二者分离 辛酸一饱和硫酸铵法 _在酸性条件不(pH4.5),非lgG的蛋白成份(包括

10、白蛋白,部分免疫球蛋白),能被辛酸等短链脂肪酸沉淀,上清中剩余的蛋白主要为IgG,再用硫酸钱沉淀上清,即可获得纯度较高的IgG。,九：单克隆抗体的纯化,Page 21,单克隆抗体的鉴定,单克隆抗体纯度的鉴定:用SDS一PAGE电泳鉴定纯度 单克隆抗体敏感性(IC50)值的测定:间接竞争ELISA实验中,一般是通过IC50值来判断抗体对CAP的敏感性,故用7个不同偶联比的HAP一OVA进行ELISA实验,测定不同偶联比的包被抗原对应的IC50值。 单克隆抗体特异性的测定(交叉反应) 做间接竞争ELIsA,计算各自的ICS。值,计算交叉反应率。,如果含有与待测物相似结构或部分相同结构的物质存在交叉

11、反应,将测定 结果升高,导致假阳性,一般以交叉反应率表示,交叉反应率越小,说明抗体 特异性越好。,Page 22,7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定,将单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C 小鼠IgA, IgG1,IgG2a, IgG2b、IgG3,IgM抗体，作双向琼脂扩散试验。 ELISA方法 用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，腹水效价在105107之间的可用于实际应用。,Page 23,文献学习,Page 24,氯霉素单克隆抗体的制备以及胶体金快速诊断方法的初步建立,Page 25,Page 26,胶体金免疫检测的基本原理 胶体金(colloidal gold)是在还原剂如氯金酸、梓檬酸三钠、白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞋酸等作用下29,首先聚合成为具有一定大小的金核颗粒,在颗粒外侧形成内正外负的两层带负电荷的疏水胶体溶液,再借助静电作用和蛋白结构中的正电荷结合形成一