第十章 新酶的发现与筛选.ppt

1、酶工程,第十章 新酶的发现与筛选,一、 新酶的来源,酶筛选的任务： 寻找包含所需酶活性的微生物菌株，或编码所需酶的基因，以实现特定的生化反应。,2020/8/2,2,第10章 新酶的发现与筛选,酶的来源： 动物细胞、组织液或分泌物； 植物细胞、组织液或分泌物； 微生物细胞（主要，80%以上）,微生物作为酶源的优点,（1）种类繁多、分布广 微生物“无孔不入，随遇而安” 微生物具有多样性 物种多样性：据估计总类别在50万至600万之间 生理代谢类型多样性：有机物和有毒物质分解、转化 遗传基因多样性：已完成测序细菌1214种、古细菌93种、真菌17种（2010年数据）,2020/8/2,3,第10章

2、 新酶的发现与筛选,微生物作为酶源的优点,（2）培养简便、繁殖快、发酵周期短，能控制培养条件大幅度提高酶的产量。 （3）微生物易变异，可采用各种遗传变异手段，培育出新的、更理想的菌株。,2020/8/2,4,第10章 新酶的发现与筛选,二、 微生物新酶的获取途径,2020/8/2,5,第10章 新酶的发现与筛选,1、 购买商品化的酶,向酶制剂供应商购买商品化的酶 世界主要酶制剂供应商：Sigma、Novo Nordisk、ThermoGen、Roche Molecular Biochemicals 等,2020/8/2,6,第10章 新酶的发现与筛选,特点： 方便易得，可大量供应 种类少、成本

3、高、知识产权问题,2、 购买产酶微生物,从菌种保藏库购买酶来源微生物 国内外主要菌种保藏机构：ATCC、DSMZ、CCTCC、CICC、CGMCC,2020/8/2,7,第10章 新酶的发现与筛选,特点： 方便易得，成本较低（600-800元/株） 需要进一步筛选,3、 从自然界筛选产酶微生物,从土壤、水体中筛选产酶微生物 广泛采用，盲目，工作量大,2020/8/2,8,第10章 新酶的发现与筛选,3、 从自然界筛选产酶微生物,从基因克隆库筛选,2020/8/2,9,第10章 新酶的发现与筛选,克隆库构建方法： 基因组狩猎 基因挖掘 宏基因组筛选,三、 新酶筛选的策略,新酶筛选的一般规律（原则

4、）,2020/8/2,10,第10章 新酶的发现与筛选,筛选前回答三个问题 明确反应目标：筛选什么酶？ 在合适的微生物群体中筛选：从哪里筛？ 确立高效筛选方法：用什么样的筛选方法？,三、 新酶筛选的策略,1、筛选什么样的酶,2020/8/2,11,第10章 新酶的发现与筛选,根据需要实现的化学反应，选择所需酶的类型 了解化学反应对于酶性质的要求，比如对温度、pH、盐浓度等的耐受力等,三、 新酶筛选的策略,2、从哪里筛,2020/8/2,12,第10章 新酶的发现与筛选,主要筛选对象：水体和土壤 采集场所： 淀粉酶产生菌：面粉厂周围 纤维素酶产生菌：腐败树叶层下 脂肪酶产生菌：油脂厂附近 蛋白酶

5、产生菌：蚕丝、豆饼等腐败变质的地方 嗜极微生物：火山口、盐碱地、深海、极地冰层下等,三、 新酶筛选的策略,3、筛选方法 （1）分级筛选法,2020/8/2,13,第10章 新酶的发现与筛选,初筛：迅速定性或粗略定量鉴别，除去大多数不符合要求的菌种或酶。平板筛选法、多孔板法等 复筛：精确测定酶活，筛选出需要的酶或产酶微生物。常采用HPLC或GC,三、 新酶筛选的策略,3、筛选方法 （2）高通量筛选法,2020/8/2,14,第10章 新酶的发现与筛选,方法：多孔板培养微生物，并用酶标仪进行光谱分析。 原理：反应产物具有吸收峰值，发光或产生荧光。,四、 从自然界筛选产酶微生物,2020/8/2,1

6、5,第10章 新酶的发现与筛选,筛选流程,四、 从自然界筛选产酶微生物,1、样品采集,2020/8/2,16,第10章 新酶的发现与筛选,方法：根据所要实现的化学反应确定需要的酶及产酶微生物的类型，选择采样环境 土样采集方法：除去表层土，取离地面515 cm处的土样，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中，扎紧，标明时间、地点、天气和周围环境等信息。,四、 从自然界筛选产酶微生物,2、富集培养,2020/8/2,17,第10章 新酶的发现与筛选,目的：使目的菌株大量繁殖，成为优势菌株 原理：根据微生物的特点，“投其所好”或“取其所抗”，在培养基中投放或添加特殊养分或抗菌物质，使天然环境中劣势菌转变为人工环境

7、中的优势菌。,富集培养方法,（1）控制培养基的营养成分,2020/8/2,18,第10章 新酶的发现与筛选,在培养基中加入一定量底物，筛选生长优势菌株 加入底物作为唯一碳源或氮源 逐步提高底物添加浓度，连续富集培养 用不同的培养基筛选不同类型的微生物,细菌：牛肉膏蛋白胨培养基 放线菌：高氏一号培养基 霉菌：察氏培养基 酵母：豆芽汁培养基,富集培养方法,（2）控制培养条件,2020/8/2,19,第10章 新酶的发现与筛选,控制培养pH、温度及盐浓度等 细菌、放线菌（pH7.07.5） 霉菌、酵母菌（pH4.56.0） 筛选嗜热微生物：高温 筛选嗜盐微生物：NaCl 15%20%,富集培养方法,

8、（3）抑制不需要的菌类,2020/8/2,20,第10章 新酶的发现与筛选,通过高温、高压或加入抗生素等抑制剂减少非目的微生物的数量 高温处理（80）筛选芽孢菌 抑制细菌：加入青霉素（G+）、链霉素（G-）、四环素、金霉素、孟加拉红等 抑制放线菌：青霉素、卡那霉素，安普霉素，壮观霉素等 抑制真菌：纳他霉素、井冈霉素或者制霉菌素，或者两性霉素等,富集培养方法,（4）稀释培养法,2020/8/2,21,第10章 新酶的发现与筛选,长期生长在营养贫乏的环境中的微生物对过高浓度的有机质敏感，生长受到抑制，可用稀释后的培养基进行富集培养。,四、 从自然界筛选产酶微生物,3、菌株分离纯化,2020/8/2

9、,22,第10章 新酶的发现与筛选,富集培养获得具有生长优势的菌株，但其他菌株依然存在，需要用合适的方法加以分离 分离纯化方法：稀释涂布或划线分离,四、 从自然界筛选产酶微生物,4、初筛,2020/8/2,23,第10章 新酶的发现与筛选,平板筛选法 薄层层析法 高通量筛选法,1、平板筛选法,（1）变色圈法,2020/8/2,24,第10章 新酶的发现与筛选,将指示剂掺入固体培养基中进行待选菌悬液的单菌落培养，或将指示剂喷洒在平板单菌落表面，指示剂与底物或产物反应，在菌落周围形成变色圈。,淀粉酶：淀粉（底物）+ 碘液（指示剂） 氨基酰化酶：N-乙酰氨基酸（底物）+溴甲酚紫（指示剂） 溴甲酚紫，

10、pH 6.2显紫色；pH 4.8显黄色,1、平板筛选法,（2）透明圈法,2020/8/2,25,第10章 新酶的发现与筛选,在固体培养基中掺入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景，在产特定酶菌种菌落周围会形成透明圈。,淀粉淀粉酶 几丁质几丁质酶 酪素蛋白酶 吐温脂肪酶 纤维素粉纤维素酶 -葡聚糖酶1,3- -葡聚糖,2、薄层层析法（TLC）,薄层层析,2020/8/2,26,第10章 新酶的发现与筛选,混合样品由于样本被点在薄片后，展开剂会因为毛细现象而向上移动。不同的分析物因为极性差异会以不同的速度向TLC片上端爬升，因而达到分离目的。,3、高通量筛选法,高通量筛

11、选法的概念,2020/8/2,27,第10章 新酶的发现与筛选,以分子水平或细胞水平的实验方法为基础，以多孔板形式为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对成百上千的样品进行检测分析。,特点：准确 、微量 、灵敏 、快速和廉价,2020/8/2,生物化学 第6章 生物氧化,28,高通量筛选采用的设备,2020/8/2,29,第10章 新酶的发现与筛选,96孔板,384孔板,1536孔板,深孔培养板,多通道移液器,酶标仪,高通量筛选采用的设备,2020/8/2,30,第10章 新酶的发现与筛选,3、高通量筛选法,

12、基于颜色变化的高通量筛选 反应生成有颜色的产物或有色的底物经反应后生成无色的产物，或底物/产物与其他物质反应生成有色络合物,2020/8/2,31,第10章 新酶的发现与筛选,2,4-二硝基苯肼筛选还原酶,3、高通量筛选法,基于颜色变化的高通量筛选,2020/8/2,32,第10章 新酶的发现与筛选,对硝基苯酚醚筛选水解酶,2020/8/2,33,3、高通量筛选法,基于荧光发生的高通量筛选 采用荧光底物，经酶水解后释放荧光基团，用高通量荧光计测定,2020/8/2,34,第10章 新酶的发现与筛选,伞形酮筛选水解酶，如脂肪酶 ，磷酸酶 ，糖苷酶等,3、高通量筛选法,基于荧光发生的高通量筛选 不

13、发荧光的试卤灵前体物质经过催化后 ,生成了发荧光的试卤灵,2020/8/2,35,第10章 新酶的发现与筛选,试卤灵筛选酯酶,四、 从自然界筛选产酶微生物,5、复筛,2020/8/2,36,第10章 新酶的发现与筛选,精确测定菌株产酶能力和催化活力，确认符合生产要求的菌株。方法：HPLC、GC等,四、 从自然界筛选产酶微生物,6、高产菌株选育,2020/8/2,37,第10章 新酶的发现与筛选,通过筛选得到的菌株如达不到生产要求，还需要进行改良，然后重复筛选工作。,菌株选育方法： 自然选育 诱变育种 杂交育种 外源基因转化或转导 原生质体融合,五、 从数据库中直接筛选酶基因,数据库筛选酶基因,

14、2020/8/2,38,第10章 新酶的发现与筛选,从数据库中挖掘所需功能的酶是一种更直接、有效且非常有前景的筛选方法,基因组狩猎法 基因挖掘法,NCBI数据库,2020/8/2,39,第10章 新酶的发现与筛选,NCBI (National Center for Biotechnology Information ) 美国国立生物技术信息中心 网址：/,1、 基因组狩猎法,基因组狩猎原理,2020/8/2,40,第10章 新酶的发现与筛选,对某一已经测序的微生物进行全基因组搜索和分析，从而获得候选酶基因。,主要包括以下步骤： 分析全基因组

15、序列，获得还原酶基因序列； 克隆所有基因并表达， 构建酶表达库； 筛选所需要的酶。,1、 基因组狩猎法,基因组数据,2020/8/2,41,第10章 新酶的发现与筛选,截至 2012 年 8 月，基因数据库( Genbank) 已经有超过 1 亿 3900 万个核酸序列，它们来自 488 266 个物种的基因组，其中包括 3 450 个完成测序的微生物基因组。,示例1 基因组序列搜索,查找基因组序列：Kluyveromyces lactis 搜索基因组序列中的还原酶 reductase,2020/8/2,42,第10章 新酶的发现与筛选,2、 基因挖掘法,基因组狩猎原理,2020/8/2,43

16、,第10章 新酶的发现与筛选,以已知酶为探针，与整个数据库的酶进行比对，获得中等相似度（50%70%）的酶进行克隆表达，通过功能筛选并获得所需要的酶。,2020/8/2,44,示例2 数据库比对寻找相似酶序列,酶探针的氨基酸序列,2020/8/2,45,第10章 新酶的发现与筛选,NADPH-dependent alpha-keto amide reductase Kluyveromyces marxianus GenBank: BAP73216.1 1 MTNQKFFTLS NGNKIPAVAV VGTGTKWYKA EETDATFSQE LTDIVKLSLD TVPGIVHIDA 61 AETYKTYPEL GAALKETKKP REEIFITDKF SSLHKISEDP KSALETALKK LGVDYVDLYL 121 IHSPFFDKDL NIDLETAWKQ LEELYKSGKA KNIGVSNFTV EDLKKVLAIA EIKPQVNQIE 181 FSPFLQNQTP GIVEFSQKND ILLEAYSPLG PLQKKPADAD QQPF