第9章 DNA的复制和修复2010.ppt

1、第九章 DNA的复制和修复,Chapter 9 REPLICATION AND REPAIR OF DNA,掌握真核及原核生物的遗传物质DNA复制的分 子机理（DNA的复制方式、 DNA聚合反应有关的 酶和复制过程等.） 掌握以下基本概念：中心法则，半保留复制，前导链，滞后链，复制叉，半不连续复制，冈崎片段.了解几类DNA聚合酶的催化特点、DNA复制的一般过程、以及原核细胞和真核细胞DNA合成的异同. 掌握DNA损伤和几种修复机制. 掌握DNA突变的类型.,DNA复制是半保留复制（大肠杆菌:复制双向进行，DNA聚合酶III催化核苷酸聚合反应） DNA聚合酶III同时催化两条链的合成（复制叉移动

2、,滞后链DNA的不连续合成，冈崎片段， RNA引物，冈崎片段延伸， RNA引物切除，冈崎片段连接.） DNA复制起始于细菌染色体上的唯一的ori C复制起点，终止于终止子位点(ter位点), Tus-ter复合物. 除了标准的DNA复制方式之外，还存在其它复制方式（滚环复制机制，D-环复制） 损伤的DNA可以修复（脱嘌呤，脱氨和形成胸腺嘧啶二聚体造成的DNA损伤，E.coli中存在的4种修复系统）,一 DNA的复制 二 DNA的损伤修复 三 DNA的突变 四 DNA的遗传重组,第九章 DNA的复制和修复及遗传重组,概述,DNA是生物遗传的物质基础 基因（gene）：是编码一条多肽链或功能RNA

3、（tRNA，rRNA，snRNA等）所必需的全部核苷酸序列是遗传信息的基本单位。 基因组（genome）：生物体或单倍体细胞所具有的所有遗传信息的总和。 生命遗传信息传递的核心规律 中心法则（central dogma）,转录（transcription）：DNA RNA,DNA,复制,复制（replication）：DNA DNA， 细胞分裂、增殖,转录,RNA,蛋白质,翻译,RNA复制（ RNA replication）：RNA RNA ，病毒,逆转录（reverse transcription）：RNA DNA，病毒,翻译（translation）：RNA 蛋白质,遗传信息表达,RNA复

4、制,逆转录,中心法则(Central dogma) ：,模板(template):能提供合成一条互补链所需精确信息的核酸链,（一）DNA的半保留复制 （二）DNA复制的起点和方式 （三）参与DNA复制的酶类 （四）DNA的半不连续复制 （五）E.coli 的DNA复制过程 （六）真核生物DNA的复制 （七） DNA复制的调控,一 DNA的复制,一 DNA的复制,染色体DNA复制：与细胞周期相关 染色体外遗传因子： （1）质粒： 严紧控制（stringent control）：单拷贝质粒 复制受染色体复制控制，每个细胞只有1个或少数几个拷贝。如：F1因子 松弛控制（relaxed control

5、） ：多拷贝质粒 拷贝数较多，20个/ 细胞。如:col EI （2）线粒体、叶绿体：DNA复制不受染色体复制的控制 （3）病毒：具有感染力的基因。可自我复制；也可整合到宿 主染色体上,(一)DNA的半保留复制(semiconservative replication),自我复制（self - replication） 亲本链：来自亲代的DNA链 复制链：新合成的DNA链 半保留复制是DNA复制的普遍机制。,DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样

6、。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为DNA的半保留复制。,1. DNA复制的一些基本概念: 复制子(replicon): 基因组能独立进行复制的单位 复制起点(复制原点) (origin, ori): 富含AT的区段 复制终点（terminus） 单复制子；多复制子（multireplicon） 复制叉(replication fork) 或生长点(growing point) 双向复制(bidirectional replication)； 单向复制 (unidirectional replication) 对称(等速)；不对称,(二) DNA复制的起点

7、和方式,在复制的起点处，DNA双链部分解开为单链，形成叉子形状称复制叉（replication fork）。,2. DNA复制的方式:,3-OH,A蛋白 切口序列,E: 滚动环式(rolling circle)单向复制的特殊方式噬菌体 X174 DNA噬菌体 DNA复制的后期,非洲爪蟾(Xenopus)卵母细胞中rRNA基因的扩增,复制型,F: D-环式(D-loop)或取代环式 (displacement) 线粒体DNA,1 DNA聚合反应: n1dATP+n2dGTP+ n3dCTP+n4dTTP DNA聚合酶 ，Mg2+ DNA模板,引物(3-OH） DNA + (n1+ n2 + n3

8、 + n4 )PPi 反应机制：亲核催化 DNA聚合反应特点： （1）以四种脱氧核糖核苷三磷酸为底物 （2）需要接受DNA模板的指导 （3）需要引物3- OH存在 （4）需DNA聚合酶催化，需Mg2+ （5） DNA链的生长方向为5 3 （6）产物DNA与模板是严格互补的 DNA复制的忠实性、保真性,(三) 参与DNA复制的酶类,OH 3,3,2 参与E. coli DNA复制的有关酶类:,DNA聚合酶（DNA Polymerase）： 又称 DNA nucleotidyl transferase, or DNA-directed DNA polymerase, or DNA-dependen

9、t DNA polymerase i.e. DDDPase,1) DNA聚合酶I(DNA polymerase I ，pol I)： 1956年，Kornberg 首先从大肠杆菌中发现 Kornberg酶 单链蛋白，分子中含有一个Zn原子 是一个多功能酶： （1）具有从5 3方向的DNA聚合酶功能 （2）从3 5 核酸外切酶活性：切单链，校对功能 （3）从5 3核酸外切酶活性：DNA修复 （4）从3端使DNA链发生焦磷酸解 （5）无机焦磷酸与脱氧核糖核苷三磷酸之间的 焦磷酸基交换,53聚合作用： DNA pol I 只能从已有的多核苷酸链的3-OH端延长DNA链，即必须要有Primer（多为R

10、NA，有时是DNA），Primer必须要有一个游离的3-OH。,模板： 单链DNA（单链线状DNA、单链环状DNA） 局部变成了单链的双链DNA 有切口（nick）的双链DNA 有缺口（gap）的双链DNA 注意：完整的双链DNA不能作模板,切口(nick):DNA的某一条链失去一个磷酸二酯键 缺口(gap):失去一段单链,单链线状DNA,单链环状DNA,B. 局部变成了单链 的双链DNA,C. 有切口（nick）的双链DNA,D.有缺口（gap）的双链DNA,A.单链DNA,形成分支结构,发夹环,大片段(Klenow片段)： 有聚合酶和3 5核酸外切酶的活性。 聚合及校对功能。 小片段：有5

11、 3 核酸外切酶活性。 参与DNA损伤修复，并负责切除引物。,Klenow片段,DNA pol I:,右手结构,2) DNA聚合酶II和III（pol II、 pol III）： DNA pol II：修复酶，没有5 3 核酸外切酶活性 DNA pol III：是DNA的复制酶(replicase) 全酶(holoenzyme)是由大约10种亚基组成，含Zn2+,DNA聚合酶III亚基组成,：5 3 DNA聚合 ：3 5 外切酶, 校对 核心酶 ：组建核心酶 ：核心酶二聚化 ：依赖DNA的ATP酶 ：形成复合物 ：形成复合物 复合物 ：形成复合物 (夹子装 ：形成复合物 置器) ：两个形成活动

12、夹子 提高酶持续合成能力,E. coli,3) DNA聚合酶IV和V（DNA pol IV和V）：,当DNA受到严重损伤时，可诱导产生这两种酶，以克服复制障碍为目的，跨越损伤部位进行错误倾向修复(errorprone repair)，修复缺乏准确性，突变率高。 4) DNA 连接酶(DNA ligase)： （1）细菌DNA 连接酶：以NAD作为能源 E.coli DNA ligase：催化双链DNA中，一条链切口处的 5-P与3-OH连接形成磷酸二酯键 （2）动物细胞和噬菌体DNA 连接酶：以ATP为能源 T4 DNA ligase：在模板链的基础上连接DNA和DNA之间 的切口；连接平头双

13、链DNA；连接DNA-RNA、 RNA-DNA、RNA-RNA之间的切口,P417,AMP-DNA中间体,E.coli DNA,课外阅读,5) 拓扑异构酶类:细菌DNA旋转酶(拓扑异构酶II),(1) 核酸拓扑结构( topology): 闭环DNA的空间关系: = + (L =T + W) (L)：双链闭环中两条链的互绕数或拓扑连环数.(整数) (T)： DNA构象应有的螺旋数，或称扭转数 值只与DNA分子的碱基对数目和构象有关. 对于B-型DNA来说， =碱基对数/10.4 (W)：双链闭环DNA的超螺旋数，或称缠绕数 = - 0，正超螺旋； = - 0，负超螺旋 比超螺旋（超螺旋密度）

14、= - = / 越大，表示超螺旋的程度越高 负超螺旋状态有利于DNA两条链的解开.,P419,课后复习,(2) 拓扑异构酶（topoisomerase，Top）:,拓扑异构体：除连环数不同之外，其它性质都相同的DNA分子 拓扑异构酶：引起拓扑异构反应的酶。 原核生物: I型：能使DNA一条链断裂和再连接，无须能量 只能消除负超螺旋,每次作用使值+1. 如：拓扑异构酶I，广泛存在于原核和真核生物。 拓扑异构酶I：主要集中在活性转录区，与转录有关； II型：使DNA双链断裂和再连接，每次改变的连环数为-2，引入负超螺旋时需要ATP供能。 细菌DNA旋转酶(拓扑异构酶II): 与DNA复制有关。 无

15、ATP存在时, 旋转酶可松弛负超螺旋，但不作用于正超螺旋 拓扑异构酶IV:分离环状DNA复制后形成的连锁体(catenane).,真核生物: 拓扑异构酶同样分为I型和II型。,6) DNA解螺旋酶(helicase, DNA解旋酶, DNA解链酶),DNA解螺旋酶功能：解开DNA双链 每解开一对碱基需要水解两个ATP供能。水解ATP活力需要单链DNA存在。 参与DNA复制的解螺旋酶：DnaB (5 3) 参与修复的解螺旋酶： 解螺旋酶I、II、III (5 3) rep 蛋白 (3 5) 7) 单链DNA结合蛋白(single-strand binding protein, SSB),拓扑异构

16、酶II,引物合成酶,引物合成酶,引物合成酶,引物合成酶催化合成, 它,8) 引物合成酶:,参与E. coli DNA复制的有关酶类: DNA聚合酶：pol I、II、III、IV、IV DNA连接酶：E.coli DNA ligase 拓扑异构酶类： II型(DNA旋转酶) DNA解螺旋酶： DnaB 单链DNA结合蛋白(SSB) 引物合成酶,3 真核生物的DNA聚合酶：,表 哺乳动物的DNA聚合酶（括号内是酵母）,PCNA：增殖细胞核抗原 proliferating cell nuclear antigen,(四) DNA的半不连续复制 （semidiscontinuous replicat

17、ion),(四) DNA的半不连续复制（semidiscontinuous replication),前(先)导链(leading strand)： 53连续合成。 滞后链(lagging strand，后随链)：合成方向也是53 以不连续方式合成(分段合成)。 冈崎片段(Okazaki fragments) 原核：1000-2000 nt；真核：100-200nt 引物：几个至十几nt RNA短片段( 引物合成酶),(五) E. coli 的DNA复制过程:,复制体(replisome)：在DNA合成的生长点(growth point)，即复制叉上，结合着各种与复制有关的酶和蛋白因子,形成一

18、种离散的复合体。 复制过程：起始, 延伸和终止,DnaA：识别起点（ori C）序列，并打开DNA双链 HU：类组蛋白，与DNA结合并使其弯曲，解开富含AT区 DnaB：解螺旋酶 借助ATP水解能量，沿53解开DNA链 活化引物合成酶（DnaG） DnaC：帮助DnaB结合于起点 DnaG： RNA引物合成酶 SSB：单链DNA结合蛋白。与DNA单链结合，阻止复性； 保护单链DNA不被核酸酶降解。 RNA聚合酶：促进DnaA活性；在线粒体、质粒中合成引物 DNA旋转酶：引进负超螺旋，消除解链产生的扭曲张力 Dam甲基化酶：使起点11个GATC序列的腺嘌呤N6甲基化,1. E. coli 中DN

19、A复制相关因子及其功能：,2. E. coli 中DNA复制起始:,复制起点, ori C: 245bp, nt序列高度保守,富含AT,成串排列的三个13bp序列 (开链区, 富含AT) 共有序列： GATCTNTTNTTTT, DnaA蛋白结合位点 五个9bp序列 共有序列： TT(A/T)TNCACC,大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型,HU,起始复合物 (DnaA+oriC),引发(priming) : 合成RNA引物的过程。,DNA旋转酶 SSB,3. DNA复制的延伸,5,3,3,5,3,5,3,(DNA旋转酶),持续合成,分段合成,3,5,5,3,5,3,课外阅读,课外阅读

20、,引物的消除和缺口的填补： 在合成冈崎片段后，由DNA聚合酶 I 降解引物RNA，并填补缺口。最后由DNA连接酶连成完整长链。,引物合成酶,解螺旋酶,课外阅读,大肠杆菌染色体复制的终止,复制叉2,复制叉1,终止复制叉1,终止复制叉2,终止子(terminator)位点, ter位点 Tus(terminus utilization substance): 与ter位点结合的蛋白 Tus-ter复合物:阻止一个方向的复制叉前移,终止区(terminus region),环状DNA两个复制叉在终止区相遇并停止复制，复制体解体。 残余50-100bp未复制区，通过修复方式填补。 拓扑异构酶IV（类型

21、II）作用下，解开连锁体。,4. DNA复制终止：,拓扑异构酶IV 解开连锁体,引物合成酶,前导链 滞后链,真核:RNase H1和MF-1核酸酶水解引物,DNA pol 填补空隙.,课后复习,(六) 真核生物DNA的复制,真核生物DNA复制与原核生物DNA复制大体相同，但有差异。,（1）原核生物每时每刻都在复制，而真核生物染色体DNA的复制在细胞周期的S期。,（2）原核生物DNA的复制只有1个复制起始点，而真核生物DNA的复制有许多复制起始点。,（3）原核生物与真核生物复制体组成有较大差异，DNA复制的酶不同，切除引物的酶亦不同。,表 细菌及真核生物复制体组成差异,DNA复制叉移动速度: 细

22、菌复制叉移动速度为50 000bp/min, 大肠杆菌染色体完成复制需要20 40min。 真核生物染色体DNA的复制子长度:100 200 kb，约1000个复制子/人染色体，复制叉移动速度为1 0003 000 bp/min，每一复制单位在30 60 min内复制完成，染色体完成需要6 8 h。 起始频率: 大肠杆菌复制速度取决于起始 频率，快速生长时一个染色体可 以连续发动复制。 真核生物染色体复制完成之前 起点不再重新开始复制。,（4） 原核生物与真核生物DNA的复制方式的差异：,复制起点: ori C,（5）真核生物的DNA与组蛋白组装成核小体。,核小体: 核小体的核心（组蛋白八聚体

23、） H2A，H2B，H3，H4，H1 DNA以左手螺旋绕组蛋白核心1.75圈，约146bp, 每形成一个核小体，相当于引入1.2个负超螺旋。 组蛋白的复制是全保留，原组蛋白八聚体留在前导链上；滞后链上的核小体由新合成组蛋白组装,（6） 端粒和端粒酶：,端粒（telomere）：真核生物染色体两个末端各有一个特殊结构，由成串短的重复序列组成。 端粒功能：稳定染色体末端结构，防止末端粘连； 补偿复制链5-末端的RNA引物空缺,端粒酶（ telomerase）： 一种逆转录酶。是一种含RNA的蛋白复合物, 以所含RNA为模板，反转录合成因复制而缩短的DNA 5-末端，维持端粒长度。存在于生殖细胞以及

24、癌细胞中。RNA链长约150nt, 其中含1个半拷贝的端粒重复单位的模板., 端粒在决定细胞的寿命中起重要作用. 端粒酶可作为抗癌治疗的靶位点.,进一步加工,G,T,T,(七) DNA复制的调控： 原核生物DNA复制的调控发生在起始阶段。 与DNA甲基化（Dam甲基化酶，在起点GATC序列中的腺嘌呤N6）和细胞膜的相互作用有关。 半甲基化的ori C DNA 真核生物复制调控十分复杂： 每个细胞周期只复制一次复制许可因子(replication licensing factor)；多复制子的复制时间不同步,与染色质结构、 DNA甲基化以及转录活性有关，通常活性区先复制，异染色质区晚复制; 细胞

25、周期受cdk-周期素复合物的控制.(cdk: cyclin-dependent kinase, 依赖于周期素的激酶),二 DNA的损伤与修复, DNA的损伤：某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，作用于DNA，造成DNA 结构和功能的破坏，引起生物突变和致死作用. DNA的修复主要有以下类型:,暗修复,4. 错配修复,1. 直接修复(光复活酶修复),2. 切除修复,3. 重组修复,5. SOS修复（易错修复）,二 DNA的损伤修复,(一) 错配修复（mismatch repair）： DNA复制发生错配时，错配修复系统启动，通过识别GATC序列是否被甲基化, 而找出未甲基化新链，

26、将新链中一段包含错误碱基的序列切除后重新合成。,Dam甲基化酶（Dam methylase）,E. coli,Mut S Mut L,Mut H,人类遗传性非多发性结直肠癌的病因是错配修复的基因缺陷。,MutS蛋白：识别错配的碱基。 MutH蛋白：内切酶，在子链未甲基化的5-GATC-3序列靠近鸟嘌呤的5-端造成一个切口，使包括错配碱基在内的数百个核苷酸得以切除。 MutL蛋白：将MutH和MutS蛋白连接成复合体。,(二) 直接修复（direct repair）/回复修复 ： 指无需去除碱基或核苷酸，只需一种酶经一步反应修复DNA损伤的修复机制。 较简单的修复方式，一般都能将DNA修复到原样

27、。 1. 光复活修复（photoreactive repair） ： 光复活酶修复紫外线照射引起的胸腺嘧啶二聚体（ TT ）或 CT 、CC等。 光复活酶(光解酶) photoreactivating enzyme ( photolyase ),光复活修复：,400nm 可见光,2. O6-甲基鸟嘌呤的修复 O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)能直接将DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到酶的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA。,(三) 切除修复(excision repair) ：, 在一系列酶作用下，切除DNA中的损伤部分，并以完整链为模板，合成切除部分的修复方式。 能修复多种DNA损伤

28、: 包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂、交联等。 这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的DNA修复机制。 需要多种酶作用，复制前修复 。 切除修复分成两种: 1. 碱基切除修复： 2. 核苷酸切除修复：,1. 碱基切除修复： 特异的DNA糖苷酶（glycosylase）能识别DNA链中单个的不正常碱基，并水解形成无嘌呤(apurinic)或无嘧啶位点(apyrimidinic site)即“AP”位点。后者可被AP核酸内切酶识别并切开，形成的缺口可由DNA pol I和连接酶修复。,dNTPs,I,碱基切除修复,核酸外切酶,2. 核苷酸切除修复：

29、DNA损伤较大时，由切除酶切除损伤部位，由DNA聚合酶I（或 ）和DNA连接酶填补空缺。 短片段的修复(short-patch repair) 长片段的修复(long-patch repair),FIGURE Nucleotide-excision repair in E. coli and humans.,人类核苷酸切除修复有关酶的基因缺陷: （XPA，XPB，XPC，XPD，XPF，XPG） 引起人类着色性干皮病(xeroderma pigmentosa)。 临床表现 ：严重光敏感，皮肤癌，视力缺陷，神经错乱。,(四) 重组修复： ( Recombination repair),从同源DN

30、A母链上将相应序列重组交换到子链的缺口处，再弥补母链空缺的修复方式。 重组修复的结果，损伤并未切除，随传代而“稀释”了。 复制后修复(postreplication repair),RecBCD RecA,DNA聚合酶 DNA连接酶,(五) 应急反应（SOS）和易错修复：,应急反应（SOS respones）：细胞DNA受到严重损伤或复制系统受抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的反应。包括多种效应 :诱导DNA损伤修复,诱变效应,细胞分裂的抑制以及溶源性细菌释放噬菌体等,也可能与细胞的癌变有关。 其中SOS反应诱导的DNA损伤修复系统： （1）避免差错修复：光复活、切除修复和重组 修复等，修复

31、时不引入差错。 （2）错误倾向修复: 产生缺乏校对功能的DNA聚合 酶IV和V （pol IV和pol V）。,SOS反应的机制,未诱导的细胞,靶基因,lexA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,recA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,（40个不同的位点被阻遏）,LexA(阻遏物),RecA(辅蛋白酶),+,三 DNA的突变,DNA突变（mutation）： DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。主要包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变.,(一) 突变类型： 1. 转换（transi

32、tion）：两种嘌呤（嘧啶）互换 2. 颠换（transvertion）：嘌呤(嘧啶)与嘧啶（嘌呤）互换 点突变（Point mutation） ：只有一个碱基被取代。也称作单碱基替换（single base substitution）。 错义突变 (missense mutation)：一种aa密码另一种aa密码 无义突变 (nonsense mutation)：终止密码 3. 插入（insertion）：一个或多个碱基插入DNA序列中。 非3的整数倍时，产生移码突变 (frameshift mutation)。 4. 缺失（deletion）：一个或多个碱基缺失造成的突变。 也可产生移码突

33、变。,(二) 诱变剂作用：,自然（发）突变（spontaneous mutation） ： 自然条件下产生的突变。突变率很低。 诱变(induced mutation) ：采用物理或化学因子导致的突变 诱变剂（mutagen）：能提高突变率的理化因子。 1. 物理诱变剂： 紫外线：形成嘧啶二聚体 X-射线， -射线： 高能射线直接引发突变 电离辐射产生自由基， 间接导致突变,2. 化学诱变剂：,A-TA-BrU BrU-G G-C (酮式) (烯醇式),(1) 碱基类似物 (base analog) ：,A-TAP-T AP-C G-C,碱基类似物引起的置换都是转换,(2)碱基修饰剂(base

34、 modifier)： 亚硝酸：使碱基脱氨。 AI，可与C配对 A-TI-T I-CG-C C U, 与A配对 C-GU-GU-AT-A, 烷化剂(alkylating agent)： 氮芥和硫芥：形成链内（间）G二聚体，GG 亚硝基胍：可控制突变位点。 与配对有关位置的烷化可以完全阻断碱基配对. 交联阻止了正常的修复,所以交联剂往往是强致癌剂 烷化后易脱嘌呤。 (3)嵌入染料(intercalating dye)：P434 溴乙啶（EB）、吖啶橙、原黄素： 扁平分子，可插入碱基对之间， 使两链错位，复制时导致核苷酸插入 或缺失，造成移码突变 。,碱基修饰剂,m7G-T,（一） 同源重组 （二

35、） 特异位点重组 （三） 转座重组,四 DNA的遗传重组,在遗传学和分子生 物学课中详细介绍,遗传重组(genetic recombination ): DNA分子内或分子之间发生遗传信息的重新组合。也称为基因重排（gene rearrangement)。 重组体DNA(recombinant DNA) 重组现象广泛存在，真核生物重组一般发生在减数分裂时同源染色体之间的交换(crossover). 意义：迅速增加生物群体遗传多样性 突变和遗传重组是自然选择的前提条件 重组类型：同源重组、特异位点重组和转座重组等,重组的类型： （1）同源重组 (homologous recombination

36、)：反应涉及到大片段同源DNA序列之间的交换。其主要特点是需要RecA蛋白的介入。 （2）位点特异性重组(site-specific recombination):重组发生在特殊位点(重组位点)上，此位点含有短的同源序列，供重组酶和辅助因子的识别和作用。 （3）转座重组（transposition recombination）：由转座子产生的特殊的行为。转座的机制依赖DNA的交错剪切和复制，但不依赖于同源序列。,同源重组：一般性重组，由两条同源区的DNA分子，通过 配对、断链、再连接，产生片段交换的过程。 1. Holliday 模型： 1964年提出,（一） 同源重组（homologous

37、recombination),Holliday中间体,异源双链区两侧为 不同亲本DNA,异源双 链DNA,2 双链断裂模型,DNA双链断裂启动同源重组，也启动了减数分裂 同源重组是最基本的重组方式，也参与基因加工、整合、转化 参与复制、重组、重组修复三个相关过程的许多酶和辅因子是共用的,3,3,Rec BCD,chi（GCTGGTGG）,Rec A蛋白,RuvAB,RuvC，ATTG,RecA引发 链侵入模型,RuvB hexamer,(helical filament),RecA水解ATP供能,螺旋状纤丝,(二) 特异位点重组 (site-specific recombination),特异

38、位点重组：在重组酶和辅助因子的识别和作用下，在 DNA特定的短序列(20200bp)(重组位点)内发生的重组。 发生：某些基因表达的调节、发育过程中DNA程序性重排、病毒或质粒复制过程中的整合或切除等 1 特异位点重组类型： 重组的结果取决于重组位点的方向和位置： (1) 重组位点若同向、位于同一DNA分子上 切除,（2）重组位点同向、位于不同DNA分子上 整合,例如：-噬菌体的整合与切除,-噬菌体 DNA,细菌DNA,整合酶 + 整合宿主因子 + Xis蛋白,att P,att B,att L,att R,原噬菌体 溶源性细菌 (lysogen),phage的整合与切除,特异重组位点-附着位

39、点（attachment site，att）,核心序列：15bp, O区,attB,attP,OB1,OB2,OP1,OP2,交错7bp切开DNA,例如：鼠伤寒沙门氏杆菌H片段的倒位,（3）重组位点反向、位于同一DNA分子上 倒位,鞭毛 相变,14bp特异重组位点：hix,2 免疫球蛋白基因重排与DNA多样性：,免疫球蛋白（抗体，Ig)分子结构: 轻链（L链）： 、 重链（H链）： 、 抗体： IgG、IgM、IgA、IgD 、IgE 轻链和重链都由可变区（V区）和恒定区（C）区组成 由3个独立的基因家族分别编码免疫球蛋白 重链基因（位于人14号染色体） 和 （2号染色体）、 （22号染色体）

40、两个轻链。, 免疫球蛋白基因结构：,轻链基因片段：L(前导)、V (可变) 、J (连接) 、C (恒定) 重链基因片段： L、V、D (多样性) 、J、C,(3) 免疫球蛋白基因重排机制：,骨髓干细胞 B淋巴细胞 可变区重排顺序：重链V-D-J重排 链V-J重排链重排 等位基因排斥(allelic exclusion);同型性排斥(isotypic exclusion) 重组信号序列（recombination signal sequence, RSS）,浆细胞 抗体,12-23规则, 轻链中： 链V下游与J上游的RSS方向相反 (间隔序列12、23), 链(间隔序列 23、12),23 b

41、p spacer 12 bp spacer,回文七核苷酸,富含A的九核苷酸,D下游和J上游的RSS方向也相反（12、23）, 重链中：V下游与D上游的RSS方向相反(间隔序列23、12),23 bp spacer 12 bp spacer 12 bp spacer 23 bp spacer,重组顺序：先 D-J，再 V-D-J,OH,5,3,OH,RSS,RSS,D,J,N核苷酸,重组酶识别RSS 并交错切开回文7核苷酸与基因接头处,亲核攻击,亲核攻击,随机 切开,切割,P核苷酸,添加,补齐并连接,重组酶RAG1/RAG2识别的二级结构,7nt,7nt,9nt,9nt,重链基因C片段的转换：转

42、换区(switch region, S区): C片段的5端，成串的重复序列,(4) 免疫球蛋白基因重排与DNA多样性,V 区和C 区不同基因片段的各种排列组合是形成抗体多态性的根本原因重组种系理论（利根川进）。 抗体基因重排导致的变化频率：1012 重链V-D-J重排的变化频率： 300 (VH基因)20 (DH)6 (JH) N区因素连接不精确因素 = 2.4 107 轻链重排多样性程度：5 103 人类CH基因簇含有10个基因： C、C 、C3、C1、C4、C1、C2、C4、C、C2 RNA水平上的剪切方式导致的多样性 体细胞突变导致多样性：重排使可变区突变频率大为提高,（三） 转座重组,

43、1940s由McClintock发现，1983年Nobel Prize 生理学/医学奖。 转座子（transposon，Tn）： 转座子是基因组中一段可移动的DNA 序列，可以通过切割、重新整合等一系列 过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。 转座的遗传学效应： （1）转座引起插入突变。插在操纵子处，还产生极性突变 （2）产生新基因：带入抗药性基因等 （3）染色体畸变：两个转座子位置相近时，导致缺失、倒位 （4）引起生物进化,( transpositionnal recombination),1 细菌中的转座子：,（1）插入序列（insertional sequence, IS)：末端具

44、有反向重复 序列的小DNA片段（1kb），除了 转座所需要的基因外不携带任何标记 基因。是最简单的转座子。 （2）转座子：除了转座所需要的基因外还携带其它标记基因 组合型转座子(composite transposon)：IS 标记基因IS 复合型转座子(complex transposon)： 无IS序列，含转座酶基因、解离酶基因及标记基因，两端为反向重复序列，体积大(5000bp)。例如：TnA 家族,1 2 3 4 - -4321 1234- -4 3 2 1,组合转座子结构,（常见）,（3） 转座过程及机制：,插入：所有转座的共同特征是在插入靶序列后，在 转座子两侧形成4 15bp的正

45、向重复序列。,转座酶,（常见5bp和9bp）,复制转座和非复制转座,2 真核生物中的转座子：,与细菌类似，一般以非复制方式转座，通常只移动到邻近位置 (1) 玉米中的转座子： 自主性因子：编码转座酶，可自主发生转座。 非自主性因子：不能自主转座，只有同家族自主性因子 存在时，才具备转座功能。 Ac-Ds系统(activator-dissociation system，激活-解离系统)： Ac：激活因子，为自主性因子 4.5kb，11bp末端反向重复，8bp靶序列正向重复。 Ds：非自主性因子，与Ac同源，但不同程度缺失中间序 列，不具有自主转座功能,玉米紫色,玉米无色,玉米花斑,(2) Spm

46、 (suppressor-promoter-mutator) /En家族：,自主因子：Spm和 En，只有约10bp差异。 Spm为8.3kb, 13bp末端反向重复，3bp靶序列正向重复 非自主因子为dSpm， defective Spm, 有缺陷的Spm因子 。 转座效果取决于插入部位： 若插入基因的外显子中：可被转录，自身编码蛋白抑制表达 可结合于靶部位，阻止转录。 若插入基因附近：不被转录，自身携带的增强子(enhancer) 可促进靶基因转录活性。,抑制-促进-增变系统,(3) 果蝇转座子： P因子（P element） 与杂种不育（hybrid dysgenesis） 非复制方式转

47、座，引起P位点染色体断裂 靶序列处产生8bp(GGCCAGAC)正向重复序列 内含子3在体细胞中可被特异蛋白结合而不被切除, P因子产物为转座阻遏蛋白（66kDa) 。在生殖细胞中无特异蛋白，切除内含子3后，P因子蛋白产物是转座酶（87kDa) 。 但是P系细胞质中含有抑制P因子转座的阻遏蛋白 杂种不育：,P因子:2.9kb,区分并掌握下列各对术语：a) DNA聚合酶I/DNA聚合酶IIIb) 前导链/滞后链c) 切除修复/直接修复/错配修复/重组修复/SOS修复d) 5-3外切酶/3-5外切酶e) DNA解螺旋酶/DNA连接酶f) 端粒，端粒酶 2. 简述MeselsonStahl的实验，并

48、解释其如何证明了DNA是半保留复制的? 3. 有哪些因素可以导致DNA的损伤，机体通过什么机制对其进行修复？ 4. 简述真核生物进行不连续DNA复制时，在复制叉处发生的一系列步骤。 5. 简述滚环复制的机制.,6 在E.coli中进行DNA复制至少需要哪些蛋白？每个蛋白的功能是什么？复制的步骤？ 7.果蝇的整个基因组包含1.65108个碱基对，如果复制仅靠单一一个复制叉复制，复制速度为每秒30个碱基对,计算整个基因组至少需要多少时间？（a） 复制在一个双向起点开始。（b） 复制在2000个双向起点处起始。（c） 在早期胚胎阶段速度最快，只需5至6分钟，此时必需的起始点至少要多少? 8. DNA

49、复制复合体需要一系列的蛋白分子以便使复制叉移动，如果大肠杆菌在体外进行DNA复制至少需要哪些组分？,9.某细菌的染色体是环状的双链DNA分子，有5.2106个碱基对。(a)复制叉的移动速度是每秒1000个核苷酸，计算复制染色体所需的时间。(b)在最适条件下，细菌繁殖一代仅需25分钟。如果DNA复制最快速度是每秒1000个核基酸，且染色体只含有一个复制起始点，解释为什么细胞能分裂得这么快。 10.一条DNA有105个核苷酸残基，它的碱基组成为：A 21，G 29， C 29，及T 21，经DNA聚合酶复制得互补链。生成的双螺旋DNA为RNA聚合酶的模板，转录后得到有相同数目残基的新RNA链。（a

50、）试确定新合成的RNA的碱基组成。（b）若RNA聚合酶从DNA新链仅转录2000碱基便停止。那么所得到的新的RNA的碱基组成如何？,11与RNA分子相比，为什么DNA分子更适合用于贮存遗传信息？ 12计算DNA聚合酶以环形X174 DNA的两条互补链的等摩尔混合物为模板复制出的所有DNA的碱基组成？假设模板DNA的一条链的碱基组成是A 24.7，G 24.1， C 18.5，及T 32.7，回答此问题，需要有什么假设？ 13(a)体外DNA合成反应中加入单链结合蛋白（SSB）通常会增加DNA的产量，解释原(b)合成反应一般在体外65条件下进行，通常采用生长在高温环境中的细菌中分离出的DNA多聚酶，这有何好处?,14设计的Meselson-Stahl实验是用来确定DNA复制是半保留复制、还是全保留复制等。在该实验中，E.Coli首先在含有15NH4Cl的介质中培养一代，然后转移到含有14NH4Cl的介质中培养。如果复制是按（a）半保留复制、（b）全保留复制进行，对于每种情况，都请画一个复制进行两轮