第十八章支原体ppt.ppt

1、第十八章支原体、衣原体、立克次体、第一节支原体缺乏细胞壁，在形态上呈高度多态性，是通过除菌过滤器能够在无生命培养基中生长的最小原核细胞型微生物。 由于它们能够形成分支的细丝，因此被称为支原体。 支原体科分支原体属和解脲支原体属两个属。 致病于人的主要是肺炎支原体、人型支原体、生殖器支原体、穿通支原体和解脲等离子体。 此外，支原体常污染细胞培养，给实验室病毒分离、单克隆抗体的制备等工作带来一定困难。 一、肺炎支原体、感染遍布全球，主要侵犯呼吸系统，经滑行运动通过黏膜上皮细胞纤毛屏障，主要黏附因子为胰酶敏感表面蛋白，被称为Pl蛋白。 是青少年急性呼吸道感染的主要病原体，表现为上呼吸道感染综合征，占

2、非细菌性肺炎的13以上。 以前被认为是温和的病原体，但现在也有可能引起心肌炎、心包炎、免疫性溶血性贫血、肾炎等严重的双侧肺炎及其他系统的肺外并发症。 微生物特性，1形态和结构与酒瓶状相似，没有细胞壁，只有细胞膜。 容易着色，Giemsa染色呈淡紫色。 细胞膜中胆固醇含量多。 所有肺炎2株均含有P1蛋白，为主要特异性免疫原和血清学诊断的主要抗原。 2、抗原结构来源于细胞膜，细胞膜外层蛋白为主要抗原，常用于生长抑制试验(GIT )和代谢抑制试验(MIT )的鉴定。 GIT是将吸附型特异性抗血清的滤纸片放置在接种支原体的固体培养基上，通过孵化出现同型血清，抑制支原体生长的现象。 MIT将支原体接种含

3、抗血清的培养基中，当抗体与支原体型一致时，其支原体就不能分解葡萄糖，从而抑制酸的产生。 这两种方法可以将支原体分为几种血清型。 3培养特性为二分裂繁殖，繁殖缓慢需要胆固醇，重复传代后，呈“煎蛋”状菌落，可迅速溶解哺乳动物的红细胞。 4生化反应肺炎支原体与葡萄糖、水解精氨酸和尿素是否可用可鉴别其他支原体。 5 .抵抗力1 .对热的抵抗力一般与细菌相似。 耐冷、-70或液氮可长期冷冻保存，放置4天也不要超过3天。 2 .支原体对干燥敏感，干燥标本难以分离支原体。 没有细胞壁的青霉素不敏感。 检查程序，1 .标本采集肺炎支原体有黏细胞作用，咽拭子标本好，应采集后立即接种。 2. PCR法快速、敏感、

4、特异，目前某临床实验室用特异性引物通过该技术从患者痰中检测肺炎支原体DNA。 3 .电镜观察无细胞壁，易与细菌鉴别。 4、分离培养、牛心消化液为基础，加入由20小牛血清和新鲜酵母浸液组成的液体或固体培养基。 加入青霉素，可以防止杂菌生长。 初次分离生长缓慢，在含有5C02的条件下培养，10天内油发生了卵状菌落。 能使葡萄糖发酵产酸，不能利用精氨酸和尿素，还原美丽的蓝色。 分离培养阳性率不高，对临床诊断没有意义，但对流行病学调查具有重要意义。 五抗体检测，(1)ELISA :该方法灵敏、特异性高、快速、经济，能检测IgM和IgG的抗体，是目前诊断可靠的方法。 检测出分子量190kDa的P1蛋白，

5、3h即可完成试验，特异性高，敏感性为10 4CFUl标本。 (2)补体结合(CF )试验、试验中使用的抗原是从氯仿甲醇中提取的糖脂抗原。 2份血清试验显示，效价增加4倍的老年人或1份血清效价l:128者，80例最近有肺炎支原体感染。 (3)间接凝血试验，操作简便，灵敏度略高于补体结合试验，感染发病7 d后出现阳性，10-30达到顶峰，12-26周逐渐下降。 本试验与补体结合试验类似，主要测定lgM抗体，与生殖道支原体之间存在交叉反应。 (4)凝聚试验是非特异性的试验。方法对患者血清和o型Rh阴性红细胞进行4次凝集试验。 3376肺炎支原体感染者为阳性(有效值1:64 )。 效价越高，或者2份血

6、清上升4倍以上，肺炎支原体最近感染的可能性越高。 二、解脲支原体，又称解脲支原体，1954年Shepard是从非淋菌性尿道炎(NGU )患者尿道分泌物中分离得到的，因其尿素分解特性而被命名为解脲支原体。 在分类学上属于支原体科尿素原体属。 是人类泌尿生殖道最常见的寄生菌之一，近年来研究发现与多种疾病有关，引起国内外有关学者的广泛重视。 1 .寄居泌尿生殖道，传播途径为性接触和母婴传播。 致病机制与侵袭性酶有关。 吸附后产生磷脂酶分解细胞膜中的磷脂，尿素酶分解尿素生成氨，影响宿主细胞的生物合成。 产生IgA蛋白酶，破坏IgA的局部抗感染作用，有利于粘附和病原。 2 .非淋菌性尿道炎(NGU )，

7、可引起上行感染，引起前列腺炎或睾丸炎的阴道炎和宫颈炎可引起流产。 由于与人精子膜有共同抗原，对精子造成免疫损伤而不孕。 微生物特性，1形态构造在液体培养基中以球形为主，直径约为50-300nm，单一或双重排列，可通过微孔过滤器的G-但不易着色，姬姆萨染色呈淡蓝色。 没有细胞壁，细胞膜由三层膜构成。 内外两层由蛋白质组成，中层为脂质类，细胞内含有核糖体和双链DNA。 DNA中的10c含量为269298mol。 2培养特性、营养要求高，需要提供胆固醇和酵母，常用的基础培养基为牛心消化液。 37生长良好，22生长差，42不生长，最佳pH为55-65。 在含有95N2和5C02的气体环境下培养2天，形

8、成小菌落，呈“煎蛋”样，可放大200倍进行观察，因此被称为t株。 生长除胆固醇外还需要尿素，尿素酶水解尿素生成氨，不分解葡萄糖和精氨酸。 3、抗原结构、脂多糖、尿素酶和蛋白质抗原，16个血清型分为a、b两大组，其中4型引起疾病的频率较高。 a组各型均含有16kD和17kD多肽的b组各型仅含有17kD多肽，而13血清型仅含有16kD多肽，以能够识别16kD和17kD多肽的单抗作为血清组特异性标记。 4抵抗力由于无细胞壁，对渗透作用特别敏感，易溶于脂质溶剂、洗涤剂、酒精、特异性抗体和补体。 对热的抵抗力差。 4可以生存约2周，70可以生存23年。 对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，对影响细胞浆

9、蛋白合成的抗生素敏感：金霉素、红霉素、金霉素、白霉素、幽门霉素、氯霉素、麦霉素、链霉素、丁酰微生物检查，1标本采集无菌瓶收集诊断包括非淋菌性尿道炎患者中段尿、慢性前列腺炎按摩后前列腺液、不明原因不育症患者精液、阴道炎和宫颈炎患者炎症性分泌物、羊水和血液等。 尿标本无菌方法取10ml，离心沉渣为接种物。 2标本直接检测，(1)核检16个血清型均有460 BP DNA片段。 通过PCR产物的核酸杂交和序列分析，可以鉴别分类各种支原体。 本法敏感性高、稳定可靠、快速简便，是临床快速诊断的重要实验手段。 DNA探针技术敏感，可以测定50100pg的DNA。 (2)ELISA能检测血清型，也能检测Ig类

10、型(IgM，IgG )，敏感特异性强，具有诊断意义。 (3)免疫斑点试验(IDT )检测抗原提取物和培养物。 该方法敏感特异，无需特殊器械，易于推广，可作为临床感染者病原检查的特异诊断方法。 进行3分离和鉴定，将样品O102ml接种pH60，用含有酚红和尿素的液体培养37孵化，颜色以变黄的红色者为阳性。 阳性者转种到固体培养基中，琼脂培养基中有尿素、005molHEPES缓冲液和MgS04，菌落易于黑褐色识别，在95N25C02或微厌氧环境下进行次代培养，用低倍镜观察菌落形态。经形态和生化反应等检验可进行初步鉴定。 只分解尿素，葡萄糖和精氨酸不分解。 以特异抗血清为MIT和GIT进行进一步鉴定

11、。 三、穿透支原体，大量复制为淋巴细胞和单核吞噬细胞，可导致宿主细胞损伤和死亡。 它能促进HIV的复制和病程的发展，是艾滋病的辅助原因。 棒状，一端为尖形结构。 营养要求高，菌落呈荷包蛋样，生长缓慢，初代10天以上，发酵葡萄糖水解精氨酸，但不分解尿素，液体培养基生长时无明显混浊或沉淀。 对红霉素、四环素、林可霉素敏感，但对青霉素不敏感。 微生物检查，1标本采集对象为AIDS患者或HIV感染者。 用咽拭子。 选择SP-4培养基进行分离培养，培养37温箱，每天观察有无颜色变化，如果由红变黄透明无沉淀，则视为“培养可疑的阳性”，用过滤器进行过滤。 滤液传代，培养基颜色再次由红变为黄，被认为是“初代培

12、养阳性”。 3 .鉴定、生化反应(1)培养物被接种含有1葡萄糖的SP-4培养基(发酵葡萄糖试验)，如果能够将其分解，培养基色就由红变为黄。 (2)培养物被接种含有精氨殿(不含葡萄糖)的sp4培养基(水解精氨基酸试验)，如果能够将其水解，pH值就会上升。 (3)培养物接种只含有尿素的sp4培养基(分解尿素试验)，观察了pH变化。 代谢抑制试验(MIT )，采集104CFUml的阳性培养物，分别加入2株改良的SP-4培养基，其中1株以适量的抗Mpe标准血清作为试管，另1株不加入抗血清作为对照管，培养37株。 试管的颜色不变(成长被抑制)，对照管的颜色从红色变成黄色(支撑体成长)。 生长受杭血清抑制

13、的微管为MIT阳性，该培养物为Mpe，并根据抗血清的类型进行Mpe分型。 PCR、Mpe外套PCR(nPCR )、靶基因是Mpe的16SrRNA基因特异片段。 Mpe-nPCR的最终扩增长度为410bp，可根据试剂盒说明书进行操作，扩增特异性MpeDNA，该方法被认为是更敏锐、特异、快速的Mpe检测方法。 抗体检查，国外学者在HIV感染者中用ELISA法检测到大量的Mpe抗体，其中无症状者的阳性率为20，艾滋病者为40，阴性对照为0.3。 第二节衣原体是一种特异性细胞内寄生，具有独特的发育周期，可以通过细菌滤膜的原核细胞型微生物。 属于广义细菌范畴。 衣原体科有衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉螺热衣原

14、体、家畜衣原体4种。 一、沙眼衣原体不仅可引起眼部感染，还可引起生殖泌尿系感染、性淋巴肉芽肿及其他脏器疾病。 近年来，沙眼衣原体的感染率和危害性超越淋球菌位于性传播疾病的首位，日益受到医学界的重视。 沙眼衣原体有沙眼生物变种、性病淋巴肉芽肿生物变种(LGV )和鼠生物变种3种生物变种。 1沙眼亚种，(1)沙眼：通过眼手眼路径直接或间接密切接触传播。 起因于a、b、Ba、c血清型。 结膜引起了局部炎症。 有滤泡增生。 后期出现瘢痕和角膜血管，影响视力。 (2)封体结膜炎：起因于b、Ba、d、Da等血清型。 婴儿因产道感染引起滤泡性结膜炎，角膜血管未出现隆起。 (3)泌尿生殖道感染：由dk血清型引

15、起。 性接触传播引起的非淋菌性泌尿生殖道感染(5060 )。 容易发展为持续感染或无症状携带者。 2、性病淋巴肉芽肿亚种，l血清型引起性病淋巴肉芽肿。 侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。 3、小鼠的生物变种是小鼠之间的传播，不侵犯人，与小鼠肺炎有关。 微生物特性、1发育周期和形态染色衣原体具有特殊的发育周期。原体以细胞外存在的形式，呈卵圆形，具有细胞壁和拟核，发育成熟的衣原体，是具有高感染性，可吸附于敏感细胞特异受体而形成网状结构的网状结构或始体，圆形、二分裂增殖为繁殖型，无感染性。 感染24h后浓缩形成原体，最后细胞破裂释放原体，感染其他细胞，每个发育周期需要约4872h

16、。 抗原结构复杂，有属、种、型等特异性抗原。 (1)特异性抗原：细胞壁LPS，特异性补体结合抗原，应应用于血清学诊断。 (2)种特异性抗原：位于主要外膜蛋白(MOMP )上，可通过补体结合试验和中和试验检出。 (3)型特异性抗原：也位于MOMP上，以单克隆抗体作为微量免疫荧光试验可识别沙眼体的18型。 培养特性、沙眼衣原体专性活细胞内寄生、68d龄鸡胚蛋黄囊及各种传代细肋培养。 培养4872h后，在细胞内发现封入体及原体和始体粒子。 近年来，细胞培养衣原体被广泛使用，常用的细胞株是Hela-299和McCoy。 抵抗力、沙眼衣原体感染材料在37条件下48h左右时失去活力，566 min时失去活

17、性。 70可保存数年，冷冻干燥保存30年以上仍有活性。 O.1甲醛或O.5酚溶液24h杀死衣原体，2来苏5min即可。 红霉素、四环素、阿霉素或青霉素对衣原体有抑制作用。 沙眼和包涵体结膜炎患者，用擦子在结膜涂抹圆顶，刮结膜。 性病淋巴肉芽肿：提取淋巴结脓汁，也可以用直肠拭子或活检材料进行检查。 用光学显微镜观察包涵体具有诊断意义，特别是在眼结膜、尿道及宫颈上皮细胞内发现典型包涵体，可作为衣原体感染的参考。 免疫学方法，1 )免疫荧光检测：荧光抗体检测上皮细胞内衣原体抗原。 标记抗衣原体LPS抗体，可与所有衣原体反应的抗MOMP抗体具有型特异性。 在1h内可以制造诊断，可以进行分离。 2 )酶

18、联免疫检查：可在数小时内检测沙眼衣原体可溶性抗原，适合同时检测大量标本。 核检，1 )核酸杂交：用125I标记衣原体rDNA探针检测宫颈标本的敏感性和特异性，与培养比较分别为82.8和99.4。 2)PCR :具有高度的敏感性和特异性。 按照衣原体75kb质粒、MOMP序列和16SrRNA基因序列修饰引物。 分离培养，擦拭标本，用含抗生素稀释液制成10-20悬浮液。 分离的细胞有McCoy、HeLa-229细胞等。 用5CO2培养。 初代分离培养72-96h后传代或盲传。 90例症状患者标本第一代可见包涵体，无症状患者必须经传代后才能获得阳性。 感受性为80-90，特异性为100，是目前确诊最可靠的方法，且是评价实验室诊断法的标准。 在鸡胚培养、有细菌污染的临床标本中加入适当的抗生素(如链霉素、庆大霉素和抑制霉素等)肉汤，室温使lh作用后，接种3-4只孵化7天的鸡胚卵黄囊，35孵化，观察到13天，获得卵黄囊涂片，Gimenez染色同定，1 .用Giemsa或碘染色对细胞培养盖片的细胞质内封入体进行镜检。 Giemsa染色比碘染色敏感，可作为沙眼衣原体鉴别的参考。 2 .可用型特异性荧光血清鉴定其类型。 蛋黄囊和小鼠分离的材料可以用免疫荧光法鉴定原体或补体结合抗原。抗体检测、眼前检测抗体的血清学方法在常规临