基础生物化学--酶.ppt

1、生物化学,酶的特征、结构及功能,主讲：赵国芬副教授,酶学之一,酶,【目的与要求】,3.1 酶的一般概念,3.2 酶的结构与功能的关系,酶,【目的与要求】,重点掌握,酶促反应 动力学的 影响因素,pH,温度,底物浓度（米氏方程、Km),抑制剂(两种可逆抑制作用的动力学特点),酶的作用特点,活性中心、变构酶、 辅酶和辅基,酶的浓度,酶,【目的与要求】,酶的分离提纯的一般方法 酶活力、比活力的概念及其测定方法 酶的分类和命名、酶原激活、酶的催化机理。,多酶体系,共价调节酶,同工酶,基本掌握,一般了解,3.1酶的一般概念,3.1 酶的一般概念,一. 酶的概念及化学本质,酶是生物体内具有特殊催化活性和特

2、定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸，又称为生物催化剂。 绝大多数酶是蛋白质,少数是核酸RNA，后者称为核酶。,酶的概念：,2. 酶的化学本质：,3.1 酶的一般概念,二、酶的组成与分类,（一）根据酶的组成成分，酶可分为：单成分酶（单纯酶）、 多成分酶（复合酶）,3.1 酶的一般概念,酶的辅助因子可以是 （1）.金属离子： 常见酶含有的金属离子有K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、(或Cu+)、Zn2+和Fe2+(或Fe3+)等。,（2）.小分子有机化合物： 即一些稳定的小分子有机物质，其主要作用是在反应中传递电子、质子或一些基团。,大多数维生素(特别是B族维生素)是组成许多酶的辅酶或辅基

3、的成分。,3.1 酶的一般概念,3.1 酶的一般概念,（二）根据酶的结构特点及分子组成形式分为：,1.单体酶 ： 只含一条肽链，分子量小。 大多数水解酶属于此类。,2.寡聚酶： 由几条或几十条多肽链组成，每条肽链是一个亚基，单独的亚基无酶的活力。 如：己糖激酶、乳酸脱氢酶，均含四个亚基， 谷氨酸脱氢酶含六个亚基。,3.1 酶的一般概念,若干个功能相关的酶彼此嵌合形成的复合体。 每个单独的酶都具有活性，当它们形成复合体时，可催化某一特定的链式反应。 如丙酮酸氧化脱羧酶复合体，含三个酶六个辅助因子； 脂肪酸合成酶复合体，含有六个酶及一个非酶蛋白质。,3.多酶复合体：,3.1 酶的一般概念,3.1

4、酶的一般概念,3.1 酶的一般概念,3.1 酶的一般概念,（三）根据酶的存在状态分类,在合成分泌后定位于细胞内发生作用的酶。 大多数的酶属于此类。,在合成后分泌到细胞外发生作用的酶， 主要为水解酶。,1.胞内酶：,2.胞外酶：,3.1 酶的一般概念,三、酶催化作用的特性,（一）酶与普通催化剂的共性：,1. 能缩短达到平衡的时间； 2. 降低化学反应的活化能； 3. 反应前后数量、性质不变。,3.1 酶的一般概念,3.1 酶的一般概念,3.1 酶的一般概念,（二）酶的催化特性,1. 酶具有高效性,酶的催化效率是非催化的1081020,酶的催化效率是普通催化的1071013,因为酶能使活化能降得更

5、低,3.1 酶的一般概念,2. 酶具有高度专一性,绝对专一性,相对专一性,立体异构专一性,3. 酶的活性具有可调控性,酶浓度调节,酶活性调节,激素调节,4. 酶具有高度的不稳定性,3.1 酶的一般概念,（三）酶的专一性(specificity),指酶对所作用底物(substrate)的选择性。,指一种酶只选择一种底物作用，如脲酶。,脲酶,2NH3+CO2,NH2CONH2+H2O,1.绝对专一性(absolute specificity)：,3.1 酶的一般概念,2.相对专一性(relative specificity),作用于一类底物,键专一性(bond specificity),对所作用键

6、的选择性,基团专一性（group speicificity）,指酶对所作用的键及键一侧的基团的选择性,如：-D-葡萄糖苷酶,如：脂肪酶,3.1 酶的一般概念,3.光学专一性(optical specificity ),酶对所作用底物立体构型的选择性,如：L- 氨基酸氧化酶。,4.几何专一性(geometrical specificity ),酶对所作用底物顺反异构的选择性。,如：顺乌头酸酶,(旋光异构专一性）,3.1 酶的一般概念,(四)、酶的专一性的解释,1.锁与钥匙学说：,3.1 酶的一般概念,2.诱导契合理论:,3.1 酶的一般概念,四、酶的命名与分类,（一）酶的命名：,通常采用习惯命名

7、法,1、底物酶：,如：淀粉酶,2、反应的性质酶：,3、来源底物作用条件酶,如：细菌淀粉酶,如：脱氢酶,3.1 酶的一般概念,1961年国际酶学委员会（Enzyme Commission，EC）提出了系统命名法。,反应类型,底物名称1,：底物名称2,若底物有构型，也需标出。,3.1 酶的一般概念,3.1 酶的一般概念,根据酶所催化反应的性质，由酶学委员会规定，将酶分为六大类：,（二）酶的系统分类方法：,1.氧化还原酶类：,通式：AH2+BBH2+A,如：乳酸脱氢酶,3.1 酶的一般概念,2.转移酶类：,通式：,如：转氨酶,AR+B,BR+A,3.1 酶的一般概念,3. 水解酶类：,AH+BOH,

8、通式：,AB+H2O,3.1 酶的一般概念,通式：,4.裂合酶类：,AB,A+B,主要包括醛缩酶、水化酶和脱氨酶,3.1 酶的一般概念,5.异构酶类：,催化异构体的底物之间相互转换,通式：,A,B,A、B为异构体,3.1 酶的一般概念,CH3COC0A+CO2+ATPHOOCCH2COC0A+AMP+PPi,6.合成酶类：,如：乙酰辅酶A羧化酶催化的反应：,通式：,A+B,+ATP,AB,+ADP+Pi,或,A+B,+ATP,+AMP+PPi,AB,3.1 酶的一般概念,五、酶的系统编号,酶的系统编号由“EC”加四个阿拉伯数字组成，,每个数字之间以“.”隔开。,3.2 酶的结构与功能的关系,3

9、.2 酶的结构与功能的关系,一、酶的活性中心与必需基团,（一）酶的活性中心(active center),酶分子上与底物直接接触并直接参与反应的微小区域。,对于结合酶来说，辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分。,3.2 酶的结构与功能的关系,活性中心的部位：,催化部位,结合部位,活性中心在结构上的特点：,.该中心占酶总体积的很小一部分； .活性中心具有三维结构； .E与S结合的专一性取决于活性中心的原子的精细排列； .底物靠非共价键与酶结合； .活性中心是一个凹穴。 对与结合蛋白酶来说，辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分。,3.2 酶的结构与功能的关系,（二）酶的必需基团(essential g

10、roup),与酶活性有关的基团称为酶的必需基团。,非贡献残基（noncontribution residue）,必需基团可分为四种：,接触残基（contact residue）,辅助残基(auxiliary residue),结构残基（structure residue）,3.2 酶的结构与功能的关系,（三）酶的活性中心的一级结构,功能类似的酶在一级结构上有惊人的相似性,蛋白质活性中心在种系进化上有严格的保守性。,用同位素标记酶的活性中心后，将酶水解，发现：,丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨酸和半胱氨酸。,酶的活性中心的基团可能在一级结构上相距很远。,3.2 酶的结构与功能的关系,3.2

11、 酶的结构与功能的关系,二、酶的活性与高级结构的关系,但高级结构是形成酶特定空间结构的保证，高级结构破坏，酶失去活性。,三、酶原激活,酶的活性与一级结构有关,酶原转化为活性的酶的过程称为酶原的激活。,无活性状态的酶的前体称为酶原(zymogen)。,酶原激活实际上是酶的活性中心形成或暴露的过程。,3.2 酶的结构与功能的关系,例：消化道的酶,血液中有关凝血酶和纤维蛋白溶解的酶类,2.可使酶在特定的部位和环境中发挥作用。,酶原激活的生理意义,1.避免蛋白酶对自身细胞进行消化；,3.2 酶的结构与功能的关系,某些酶原的激活过程,44肽,3.2 酶的结构与功能的关系,胰蛋白酶原激活示意图,3.2 酶

12、的结构与功能的关系,3.2 酶的结构与功能的关系,3.2 酶的结构与功能的关系,胃蛋白酶原的激活过程,3.2 酶的结构与功能的关系,生物化学,酶作用机理,主讲：赵国芬副教授,酶化学之二,3.3 酶催化机理,酶为什么能催化化学反应,酶如何降低化学反应活化能,酶高效性的解释,3.3 酶的催化机理,3.3 酶催化机理,一、酶为什么能催化化学反应,活化分子,活化能,活化分子数量与反应速度,活化分子数增加的途径：,加热、加压、光照,降低反应的活化能,3.3 酶催化机理,3.3 酶催化机理,二、酶如何降低化学反应的活化能 ：,证据：用吸光法的变化证明了含铁卟啉的过氧化物酶参加了反应。,中间产物学说,S +

13、 E,ES,P + E,3.3 酶催化机理,3.3 酶催化机理,三、酶的高效性的解释,1、底物与酶的邻近效应和定向效应 2、底物分子的形变和扭曲 3、共价催化 4、酸碱催化 5.金属离子的作用 6.活性部位的微环境的影响,3.3 酶催化机理,S反应基团和E的催化基团,邻近效应（底物与酶的靠近）,定向作用,酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列,反应基团之间的分子轨道以正确方向,S和S的反应基团,3.3 酶催化机理,酶与底物相互诱导，发生形变断裂,3.3 酶催化机理,3.3 酶催化机理,3.3 酶催化机理,3.3 酶催化机理,3.3 酶催化机理,3.3 酶催化机理,亲核催化,3.3 酶

14、催化机理,生物化学,酶的动力学,主讲：赵国芬副教授,酶化学之三,酶化学之三,3.4 酶促反应动力学,3.5 酶的分离提纯及活力测定,3.6 重要的酶,3.4 酶促反应动力学,3.4 酶促反应动力学,影响因素主要:,酶促反应动力学(kinetics of enzyme- catalyzed reactions),是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。,酶的浓度,底物的浓度,抑制剂,激活剂,pH,温度,测定速度要测定初速度.,?,3.4 酶促反应动力学,矩形双曲线(rectangular hyperbola),一、 底物浓度对反应速度的影响,1902年，Henri,蔗糖酶,如下图所示：,3.4 酶

15、促反应动力学,酶都有饱和现象,一级反应,混合级反应,零级反应,?,3.4 酶促反应动力学,酶促反应的动力学方程：,Michaelis和Menten的研究,3.4 酶促反应动力学,1、米氏方程的推导 根据中间产物学说：,k1,k2,k3,k4,米氏方程是在三个假设的基础上建立的： 1、反应初期，产物的生成量极少，E+PES可忽略不计； 2、S E,S-ES S 3、反应系统处于稳态平衡状态，即ES的形成速度等于ES的分解速度：dES/dtdES/dt,ES,E+S,E+P,3.4 酶促反应动力学,ES的形成速度： dES/ dtk1ES ES的分解速度： dES/ dt（k2k3）ES 稳态平衡

16、下， k1ES （k2k3）ES 即：ES/ES= （k2k3）/ k1=Km,3.4 酶促反应动力学,而E=EtES代入上式得： ES=EtS/ (KmS) 而酶促反应的生成速度即是产物的生成速度： VO k3ES=k3EtS/ (KmS) VmaxS/ (KmS) 其中： Vmax k3Et 即为酶促反应可达到的最大反应速度,3.4 酶促反应动力学,2.米氏常数的意义,（2）. Km 值表示酶与底物的亲和力；,（1）. 物理意义：,Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。,成反比,3.4 酶促反应动力学,（3）. Km 值是酶的特征性常数,酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底

17、物作用时，Km 值也不同。,各种酶的 Km 值范围很广，大致在 10-110-6 M 之间。,Km值最小的S为E的最适底物,酶所催化的底物、反应条件有关,与酶的浓度无关,只与酶的性质有关,3.4 酶促反应动力学,3. Km在实际应用中的重要意义,（1）.鉴定酶：,（2）.判断酶的最佳底物：,（3）.计算一定速度下的底物浓度：,不同条件下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。,Km最小对应的底物就是酶的天然底物。,如：某一反应要求的反应速度达到最大反应速度的99%，则S=99Km。,3.4 酶促反应动力学,（4）.了解酶的底物在体内具有的浓度水平： 一般地，体内酶的天然底物的S体内Km，如果S体内

18、Km，那么VO Vmax，底物浓度失去生理意义，也不符合实际状态。,（5）.判断反应方向或趋势： 正、逆两向的反应的Km不同，如果正、逆反应的底物浓度相当，则反应趋向于Km小对应底物的反应方向。,3.4 酶促反应动力学,4.Km求法：,A。,B.。,3.4 酶促反应动力学,称为Lineweaver-Buck方程（或双倒数方程）,方程：,此作图除用来求 Km 和 Vmax 值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值。 ,3.4 酶促反应动力学,双倒数作图法,3.4 酶促反应动力学,二. 酶浓度的影响,在一定温度和pH下， 在S E时，V与E呈正比。 机理： SE时, ES=Et V0=k3ES=k

19、3Et,3.4 酶促反应动力学,三. 温度对酶促反应速度的影响,最适温度为3540。,最适温度（optimum temperature Tm）：,反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度。,最适温度为3060，少数酶可达60以上。,如：细菌淀粉水解酶的最适温度90以上。,动物组织,植物与微生物,3.4 酶促反应动力学,低于最适温度，T增加，活化分子数增加，V增加,高于最适温度，T增加，E易失活,最适温度不是酶的特征常数，其它反应条件有关。,注意：,T,v,3.4 酶促反应动力学,四. pH对酶促反应速度的影响,酶的最适pH(optimumpH pHm),酶活力最大的pH称为酶的最适

20、pH,典型的酶速度-pH曲线是较窄的钟罩型曲线，,但有的酶的速度-pH曲线并非一定呈钟罩型。,3.4 酶促反应动力学,胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH活性曲线 ：,3.4 酶促反应动力学,3.4 酶促反应动力学,pH对酶促反应速度的影响机理：,1、pH影响酶活性基团和底物的解离:,最适pH时E与S解离最适合结合,2、pH影响酶分子的构象：,3.4 酶促反应动力学,一些酶的最适pH,3.4 酶促反应动力学,五. 激活剂对酶反应速度的影响,如：Mg+是多种激酶和合成酶的激活剂，,激活剂是相对而言的。,激活剂(activator):,能使酶活性提高的物质,大部分是离子或简单的有机化合物,动物唾液中

21、的-淀粉酶则受Cl-的激活。,3.4 酶促反应动力学,激活剂,3.4 酶促反应动力学,六、抑制剂对反应速度的影响,酶的抑制剂(inhibitor)：,凡能与酶的必需基团（主要是活性中心的）结合使酶的活性下降或丧失的试剂（不引起酶蛋白变性的物质）。,酶的变性剂：,使酶变性失活(称为酶的钝化)的物质（如酸碱）。,抑制作用,可逆性抑制,不可逆性抑制,对酶有选择性,对酶无选择性（整个三维结构）,3.4 酶促反应动力学,（一）不可逆性抑制作用 (irreversible inhibition),抑制剂以共价键方式与酶的必需基团结合而使酶丧失活性。,按其作用特点分为：,专一性,非专一性,不可用透析法去除。

22、,3.4 酶促反应动力学,3.4 酶促反应动力学,1.非专一性不可逆抑制,抑制剂与酶分子中一类或几类基团作用，既包括 必需基团，也包括非必需基团，由于其中必需基团 被抑制剂结合，从而导致酶的抑制失活。,作用部位：,巯基酶,抑制剂：,某些重金属(Pb+、Cu+、Hg+) 、 对氯汞苯甲酸,巯基丙醇或二巯基丁二酸钠,解除：,3.4 酶促反应动力学,3.4 酶促反应动力学,2.专一性不可逆抑制,专一地共价作用于酶的活性中心或其必需基团,如：有机磷杀虫剂,胆碱酯酶,乙酰胆碱,乙酸,神经系统处于过度兴奋状态，引起神经中毒症状,胆碱,活性中心丝氨酸羟基,3.4 酶促反应动力学,E,3.4 酶促反应动力学,

23、(二)可逆性抑制(reversible inhibition),这类抑制作用大致可分为：,I与E以非共价键结合，用透析等物理方法可除去的I.,非竞争性抑制作用,竞争性抑制作用,3.4 酶促反应动力学,1.竞争性抑制(competitive inhibition),(1) 含义 和 反应式,I在化学结构上与S的结构相似， I和S结合E的活性中心的同一位点， S和I与酶的结合是相互竞争。,E只能结合其中之一。,3.4 酶促反应动力学,3.4 酶促反应动力学,（2）特点：, I与S在化学结构上相似，能与S竞争酶E分子活性中心的结合基团.,3.4 酶促反应动力学,加大底物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除

24、。,Vmax不变；,Km增加,I加大,3.4 酶促反应动力学,Vi,（1 + ）S,Km,I,Ki,VmaxS,很多药物都是酶的竞争性抑制剂,如：磺胺药,二氢叶酸合成酶,对氨基苯甲酸,3.4 酶促反应动力学,磺胺药物的抑菌作用,3.4 酶促反应动力学,2.非竞争性抑制(non-competitive inhibition),(1)含义和反应式,I和S与E结合的不是同一部位，I和S可 同时结合在E上形成ESI，不能释放形成产物P。,3.4 酶促反应动力学,3.4 酶促反应动力学,（2）特点：, I和S在结构上一般不相似，E可同时结合I与S，, Km值不变，Vmax值变小。, 增加S并不能减少I对

25、E的抑制，,3.4 酶促反应动力学,非竞争性抑制,VmaxS,( 1+ ),I,Ki,Km+,( ),S,Vi,3.4 酶促反应动力学,1,Vi,（1+ ）,I,Ki,（ ）,1,Vmax,Km,Vmax,1,S,3.5 酶 的分离纯化及活力测定,3.5 酶的分离提纯及活力测定,一、酶的分离提纯,（一）酶在细胞中的分布：,直接水溶液抽提,细胞破碎，再抽提,胞外酶：,胞内酶：,3.5 酶的分离提纯及活力测定,（二）分离材料：,动植物原料或微生物的发酵液。,酶的来源、性质及纯度需要来定提取方案,3.5 酶的分离提纯及活力测定,（三）原则：,高得率、高纯度、高活性,（四）分离与纯化：,避免高温、过酸

26、、过碱、剧烈的震荡等,同蛋白,3.5 酶的分离提纯及活力测定,二、酶活力的测定,（一）酶活力的概念：,速度常表示为：-dS/dt或dP/dt,指酶催化特定化学反应的能力。,常用催化化学反应的速度表示。,3.5 酶的分离提纯及活力测定,在最适反应条件（温度25）下，每分钟内催化1微摩尔（mol）底物转化为产物所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）称为1标准单位（IU)。,（二）酶的活力单位：,在最适温度下，每秒钟能催化1摩尔底物转化为称为所需要的酶量定义为 1 Kat。,1Kat=60106 IU,3.5 酶的分离提纯及活力测定,指在Et 一定、 S E的条件下，单位时间内每一活

27、性中心或每分子酶所能转换的底物分子数。,(三)酶的比活力：,每单位酶蛋白所含的活力单位数。,固体酶,液体酶,活力单位/mg酶蛋白,活力单位/mg酶蛋白氮,活力单位/ml酶液,（四）酶的转换数,3.5 酶的分离提纯及活力测定,（五）酶活力的测定方法,1、分光光度法： 2、测压法： 3、滴定法： 4、荧光法： 5、旋光法：,3.5 酶的分离提纯及活力测定,三、回收率和纯化倍数 回收率 100,每次总活力,第一次总活力,纯化倍数,每次比活力,第一次比活力,3.6 重要的酶,3.6 重要的酶,一、变构酶与变构调节,（一）变构调节、变构酶、变构剂概念,酶分子的调节中心与某些化合物非共价结合后，引起酶的构象改变，进而改变酶的活性状态，酶的这种调节作用称为变构调节(allosteric regulation)， 具有变构调节的酶称变构酶(allosteric enzyme) ，又称为别构酶) 。,凡能使酶分子发生别构作用的物质,变构剂(effector),3.6 重要的酶,3.6 重要的酶,（二）变构酶作用特点,正协同效 应(positivecooperative effect) ， 负协同效 应（negative cooperativeeffect）。,1、一般有二个以上的底物结合位点。