细胞培养技术PPT课件.ppt

1、细胞培养基本知识，碳朝鲜，1，细胞培养理论部分内容，1，细胞培养概念：细胞培养是指用机械法或酶消化法从组织中分离细胞，模拟体内环境。即在无菌、适宜的温度、酸性、营养条件下增殖生长，维持正常结构和功能的培养体外，营造类似机体内细胞生存环境的人工环境。这样，细胞在体外生存、生长、增殖、3、3、体内、外细胞的差异、体内细胞：机体神经体液调节以及其他类型的细胞影响基因表达的过程中不断发生分化(从一般到特殊)。体外细胞：机体神经体液调节和其他类型的细胞影响细胞的许多外来信号，会削弱或中断某些分化基因表达悬浮培养细胞在液体培养基中悬浮增殖。5，5，细胞周期细胞周期：从细胞先前分裂结束到这次分裂结束所经历的

2、丘脑过程。G0期：细胞不再沿周期进入休眠状态，G1期，- DNA克隆前，主要进行，群体中的大部分细胞在肝期，少数在分裂期。分裂期比较短。可分为、6、整个细胞周期G1 S G2 M G1。如下图所示，7，细胞生长曲线，体外培养的细胞达到一定密度时，必须经过世代。上一代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量、细胞增殖速度等有关。接种细胞数量多，细胞基数大，在相同增殖速度条件下细胞数量增加，饱和速度和相对快。连续细胞系和肿瘤细胞系的增殖速度比第一代培养细胞快，培养液中血清含量多的话，细胞增殖少的时候快。细胞增殖代一般可以用，8，9，细胞生长图：来测量。用BRDU检测有丝分裂细胞。10、BRDU(

3、溴二氧嘧啶核苷)类似于胸腺嘧啶结构。在DNA合成过程中，可以像胸腺嘧啶一样混入细胞DNA。BRDU单克隆抗体免疫细胞化学法可以检测BRDU标记的结果。通过直接观察DNA合成过程，可以客观评价培养细胞增殖分化的情况。11，12，细胞死亡，细胞凋亡细胞自身节目终止，生命主动死亡过程，特征形态和生化变化，由基因控制的自主选择性自我消亡过程，这种脱落机制是保证生命进化的基础。13，细胞凋亡特征，凋亡过程表达(细胞致密的染色质边缘集合核片段凋亡的小体)1，失去特殊的表面结构(微毛等)和接触区域，形成光滑的轮廓，在周围活细胞中2，细胞缩小：细胞浆细胞集中细胞膜出芽或泡沫细胞收缩，14，短滑面内质网(SEN

4、)扩张、扩张间隔和细胞表面融合有时有积累的半结晶核糖体。可能有与细胞表面平行的微丝。4.形成网状小体，在凋亡细胞中分解成多个质膜包围的小体，每个凋亡小体都有自己的一堆细胞器。周围不会引起炎症反应。，15，5，核染色质结构的变化(这是最明显的变化)染色质聚集在核膜下，显示为核固体。边集；核浆硬。核膜起皱。16、17、Annexin V是细胞凋亡检测的敏感指标之一。它是磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的细胞膜结合，细胞质膜的变化是细胞凋亡时最早的变化之一，细胞凋亡时，膜磷脂丝氨酸(PS)从原生质膜内部向外翻，Annexin V与磷脂丝氨酸有很高的亲和力，暴露在细胞外的磷脂糖，18，细胞体外培养的影

5、响因素，血清：一般用作小牛血清(包括胎牛血清)和其他动物血清。为了多种研究目的，血清成分妨碍药物、受体及营养等研究实验时，经常需要使用无血清培养基。19，pH值：大多数细胞在pH7.4中生长得最好。一般为6.8以上，7.6以下。渗透压：培养液渗透压一般在260320 mosm/kg之间，20，培养液3360是目前常用的基础培养液(如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等)，根据培养要求采访后要尽快培养。因故不能立即培养的时候必须保存在4的培养液中，但时间不能超过24小时。采集组织时要严格保持无菌，同时避免接触其他有害物质。在采集病理组织、皮肤、消化道上皮细胞时，可以轻松带细菌，为减少污染

6、，用5001000单位/ml青青、链霉素PBS溶液冲洗510min，进行洗涤。(无论是传代培养还是原代，都要记住操作细胞，细心、集中、动作要轻)，22，原代培养：从组织中获得的细胞访问培养瓶或培养盘的过程称为原代培养。一次培养有两种茄子方法：酶消化法和组织阻滞法。(以水牛纤维细胞BEF为例，23，组织区块法：屠宰-焚烧- 3条腿肌肉的一小块- PBS洗两次-移至清洁表-绿豆粒子大小- 75%酒精浸泡1分钟- PBS洗两天后-交换液加入新的培养液。(此时组织块已附着在培养瓶底部，培养液最好浸泡在组织块中，复盖培养瓶底部。)-以后细胞到培养瓶下每2 3天交换一次。通常7-8天可以长满细胞。24，t

7、rip sin消化法，在屠宰场燃烧腿部肌肉的一小块PBS洗两次去清洁台绿豆粒子大小75%酒精浸泡1分钟PBS洗三次液体混浊基本上没有肿块的时候，把显微镜吸一下观察，发现细胞大部分分解，25，图2-1组织块培养5日水牛图2-2酶消化法培养5日水牛胎儿纤维细胞胎儿纤维细胞胎儿纤维细胞，26，前代培养细胞复盖细胞培养病底部时应立即转移细胞。否则可能会受到细胞生长的影响。每一代都叫一次“一代”。有限细胞系在体外一般只能传递数十代，但转换细胞系或细胞系可以无限继承。最好把0.25%的胰蛋白酶放在培养瓶里，正好复盖培养瓶的底部。-酶消化最好用显微镜观察大部分细胞漂浮约5分钟。-最好放入含有血清的培养液结束

8、消化-转移到离心管- 1500-，27，细胞冷冻细胞冷冻保存和恢复是细胞培养必须的步骤。细胞在体外长期培养时要及时冷冻保存，以免丢失。但是当细胞离开活体开始原代培养时，各种生物学特性逐渐变化，世代数量增加，体外培养条件变化，新的变化不断。大卫亚设，美国电视电视剧，健康)因此，及时冷冻低一代细胞是很必要的(一般来说，冷冻2-3代细胞比较好)。28、细胞冷冻原理在没有保护的情况下直接冷冻细胞时，细胞内外的水形成晶体，会引起电解质浓度增加、渗透压变化、脱水等细胞内的一系列变化。如果在培养基中放入保护剂甘油或二甲基亚砜(DMSO)，冰点降低，在缓慢的董洁条件下，细胞内的水分在冻结之前可能会渗出细胞。低

9、温保存在130以下可以减少冰晶的形成。溶解细胞时速度快，细胞必须快速通过最容易受损的50。29，冷冻方法1 2。用通常的胰蛋白酶消化细胞，根据106-107/ml细胞浓度，含有10DMSO的培养液(此时培养液要冷，因为DMSO牛仔在常温下可能会产生毒性)3。用吸管吸收细胞显液，在分成0.25毫升的细胞冷冻管中用火密封4。董洁保留4小时30分钟- 202小时- 80夜-液氮器官保留。30，解东方法1取出液氮中冻结的冷冻保管管，快速放入37水浴，在一分钟内融化。2.用75%酒精喷雾细胞冷冻管灭菌的纱布擦拭试管。-用灭菌的剪刀去除管2头-将细胞显液转移到离心管，补充培养液，1500rpm低流速离心6

10、分钟，肝细胞复苏后，应尽量去除)-扔掉上清液，放入培养液进行培养-第二天细胞贴在墙上时交换，去除死细胞-以后每2-3天交换一次。(解冻方法要快)，31，细胞活力1，细胞悬液0.5毫升放入试管。2.加入0.5毫升0.4%对帕兰染色液，染色2 3分钟。3、在幻灯片和封面上吸收一些悬浮液。4.取镜下几个随机视野，分别计数死细胞和活细胞的数量，计算细胞的活力。死细胞被染色，镜子下显示真兰色细胞，活细胞没有染色，镜子下是无色透明的，32，33，染色体检查，(1)将大生器官中的一瓶细胞放在4冰箱里12小时，扔掉旧液体，分别放入秋水仙碱(2)(3)加入1毫升新准备的固定液(甲醇：冰醋酸=3: 1)，提前3分

11、钟固定，加入离心收集细胞。(4)扔掉原影像厅，慢慢地将50分钟，低速离心收集细胞放入5ml固定液4冰箱。(5)扔掉原图像厅，加入0.7毫升固定液，反复吹，搅拌。(6) -取20冷冻幻灯片，挂在25厘米高(保持一定高度有助于染色体分散)，落在幻灯片上，在酒精灯上快速干燥，用Giemasa(原液：PBS=1:9)染色30分钟显微镜观察，34，水牛胎儿成纤维细胞染色体，35，免疫细胞染色，免疫荧光细胞化学根据抗原抗体反应的原理，首先将已知的抗体标记显示在荧光素上，然后用牙齿荧光抗体探针作为检查细胞或组织内抗原的探针。36，37，荧光抗体，(硫氰酸荧光)段宜恩，最大吸收光谱nm最大发射光谱，黄绿色荧光

12、。2，四乙基异硫氰酸罗丹明标记最大吸收光谱nm，最大发射光谱nm，橙色红色荧光，黄绿色光和对比明确，与蛋白质结合，可用于双标记研究。38，细胞免疫荧光染色的基本阶段，1，将无菌罩幻灯片放在培养皿中，培养细胞接种。2.吸收培养液，将4%的聚甲醛放入室温，固定15min(为了更好地维持细胞和组织的原始形态结构，防止组织自我溶解，需要固定细胞和组织)。固定作用不仅能凝固细胞内的蛋白质，结束或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是，最大限度地保存细胞和组织的抗原，将水溶性抗原转化为水溶性抗原，防止抗原扩散。)，39，3，吸入口服液0.01%Ttitonx-100的TBSA三次，加上Ttitonx-100的PBS室温作用1%，5min(提高细胞透明度，有助于进入抗体)4，一开始就要非常重视，积极采取措施防止污染。否则不仅会浪费时间，还会造成人力、物力，甚至无法弥补的损失。44，细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入抗生素，也可能因操作原因造成污染。最常见的是革兰