核酸类药物分析PPT课件.ppt

1、分析核酸类药物，第一节概述了第二节分析方法的第三节应用实例，第一节概述了结构和分类核酸类药物可以通过帮助恢复正常代谢或干扰某些异常代谢来达到疾病的治疗目的。 核酸是多个碱基通过，磷酸二酯键聚合而成的生物高分子，一个碱基的基本结构是核苷和磷酸，核苷是含氮碱基(嘌呤碱基和嘧啶碱基)和戊糖通过糖苷键缩合而成。 根据戊糖的种类可以将核糖核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸。 核酸、核苷酸类药物是指具有药用价值核酸、核苷酸、核苷酸和碱及它们的类似物或衍生物。 根据化学结构和组成，核酸碱及其衍生物，例如可分为硫鸟嘌呤、氟尿嘧啶、阿昔洛韦等4种核苷及其衍生物，例如肌苷、利巴韦林、糖苷； 三磷酸腺苷二钠、细胞磷胆碱

2、钠、环状磷腺苷等核苷酸及其衍生物； 寡核苷酸、核糖核酸、核糖核酸、抗肿瘤免疫核糖核酸等多核苷酸。 阿昔洛韦化学名为9-(2-羟乙氧基甲基)胍。 化学结构式：药理作用：抗病毒药。 体外对单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒等有抑制作用。 通过干扰病毒DNA聚合酶，抑制病毒复制的DNA聚合酶，与生长的DNA链结合，DNA链的延伸中断。 本品对病毒有特殊亲和力，但哺乳动物对宿主细胞毒性低。 二、理化性质溶解性多核苷酸、核苷酸类药物均为磷酸盐，除环状磷腺苷外，易溶于水。 核苷类药物在乙醇、二乙醚等有机溶剂中的溶解度差，有些核苷类药物容易溶于水(如利巴韦林)，有些核苷类药物容易溶于水(如肌苷)。

3、核酸碱类药剂大多可溶于氟胞嘧啶等酸性或碱性溶剂，可溶于稀盐酸和稀氢氧化钠溶液。 紫外吸收核苷酸的磷酸酯和戊糖没有明显的紫外吸收，但嘌呤碱基和嘧啶碱基等碱基具有共轭双键结构，在紫外光区域吸收明显。 因此，多核苷酸、核苷酸、核苷具有与构成它们的碱基类似的紫外吸收光谱，最大吸收波长很近。 酸碱性核苷酸分子结构中的磷酸和戊糖均呈酸性，其中磷酸酸性强，碱性含氮化合物呈弱碱性，因此多核苷酸、核苷酸类和核苷类药物为两性化合物。 核酸碱类药剂仅为碱，呈碱性。 水解性核苷酸类药物分子结构中磷酸与戊糖间的酯键和戊糖与碱间的糖苷键都水解，在同样的条件下酯键先水解。第二节分析方法、各种核酸类药物含碱，全部具有弱碱性和

4、紫外吸收性的多核苷酸、核苷酸、核苷酸类药物含戊糖多核苷酸和核苷酸结构含磷酸。 因此，有紫外分光光度法鉴别和含量测定等共同的分析方法。 一、鉴别(一)化学鉴别戊糖鉴别()地衣酚反应核糖核酸、核糖核苷酸或核糖核苷酸与酸共热时，水解产生的戊糖脱水成糠醛，进一步与二羟基甲苯(地衣酚)反应，缩合使用三价铁盐或铜盐作为催化剂，可以提高显色灵敏度。 地衣酚反应特异性差，戊糖均有此反应。绿色670nm、()二苯胺反应脱氧核糖核酸、脱氧核苷或脱氧核苷与酸的共热水分解产生的脱氧核糖在乙醛存在下与二苯胺反应，生成蓝色化合物，波长最大吸收。 核糖核酸、核糖核苷酸没有这个反应。 蓝色595nm，磷酸盐的鉴别核酸，核苷酸

5、系药剂在酸性条件下加热水解生成的磷酸和过剩的钼酸铵()反应，生成磷钼酸铵，放冷生成黄色沉淀。 这种反应是磷酸盐的一般鉴别试验。嘌呤碱基的鉴别含有嘌呤碱基的核酸类药物在水溶液中与氨制硝酸银试验液反应生成白色的银盐，照射到光而变化为红褐色。 该反应是嘌呤碱基的特征性鉴别反应。 氟元素的鉴别氟尿嘧啶、氟胞嘧啶等含氟有机化合物遇到三氧化铬的饱和硫酸溶液这样的强氧化剂时，在低烧条件下产生氟化氢，腐蚀玻璃表面导致硫酸溶液不能均匀地涂布在管壁上，产生水垢现象。 硫元素的同定硫鸟嘌呤分子结构中的元素，如果在甲醇钠溶液中慢慢加热，就转换为硫化氢气体，醋酸铅试验纸看起来是黑色或灰色。 嘌呤分子结构中的巯基也可与醋

6、酸铅试验液反应生成黄色沉淀。 (二)光谱鉴别.紫外吸收光谱法碱基结构中的三氟代乙磺酰氯环和嘧啶环在紫外光区域具有特征性吸收，可用于鉴别。 例如吸收系数、最大吸收波长及其一定浓度下的吸光度、最小吸收波长等。 红外吸收光谱法红外吸收光谱法主要分为标准图像对照法或对照品对照法，中国药典主要采用标准图像对照法。 红外光谱具有重叠性，共存成分能改变被测成分的红外光谱，因此红外吸收光谱法可用于高纯度原料药的鉴别。 影响红外吸收光谱的因素多为：例如试样的制造方法、水分、结晶型等，鉴别时必须严格按照规定制作图像。 对于可能发生转晶的药物，必须按照规定重结晶后制作图像。 更昔洛韦的鉴别一样，本品的红外吸收图像必

7、须与对照品的图像一致。 如果不一致，则取适量本产品和对照品，分别加水制成饱和溶液，过滤，滤液在下放置一晚，过滤，过滤渣干燥后再测定，二、检验核糖核酸、脱氧核苷酸钠多用萃取法制备，寡核苷酸用化学合成法制备核酸类药物的杂质检查包括一般杂质检查、特殊杂质检查、安全性检查。 一般的杂质检查主要有氯化物、硫酸盐、重金属、砷酸盐、铵盐、铁盐、干燥减量、治疗残渣等，安全性检查主要有细菌内毒素、异常毒性、无菌检查等，重点检查从原料带入、生产过程中引入的杂质、污染物和其他成分等特殊杂质(1)多核苷酸类药物的检查吸光度核糖核酸、脱氧核苷酸钠多使用提取法从细胞和动物的内脏制作，例如核糖核酸类是从健康的猪肝脏提取制作

8、的。 在制造过程中带入一定的蛋白质是不可避免的，吸光度检查是为了控制核酸类药物中蛋白质的含量。 具体的方法是调制一定浓度的供试液，在各自的波长下测定吸光度，该吸光度比必须是最低的。 纯波长下的吸光度比为.以上，的吸光度比为.程度，该比随着试样中的蛋白质含量增加而降低。 核糖核酸中脱氧核糖核酸的检测原理：脱氧核糖核酸中的脱氧核糖核酸在酸性条件下与二苯胺反应生成蓝色化合物，在附近有最大吸收，核糖核酸没有这个反应。 根据控制处的吸光度，可以控制脱氧核糖核酸的含量。 增色效果核酸分子的解链变性和断链时，如果其显色基碱暴露，就会引起紫外吸收增强的现象。 但是，蛋白质等其他杂质也具有增色效果，因此要求增色

9、效果不低于某个值，从而能够控制关联的杂质。 RNA要求本产品的增色效果更大时，(二)核苷酸、核苷酸、核酸碱类药物的检查有关物质的结构相似的其他非目的化合物，即有关物质。 以硫鸟氨酸中“有关物质”的检查为例进行说明。 硫鸟嘌呤是以鸟嘌呤为原料制造的，残留在最终产品中的原料、中间体、副反应生成物等的结构可能会带入与硫鸟嘌呤类似的杂质，统称为“有关物质”。在这些杂质中，鸟嘌呤是已知的杂质，对照品采用对照品对照法进行检查，其他杂质则采用不添加补正因子的主成分自对照法进行检查。 在氯含量的盐酸糖苷的生产过程中，由于盐分形成不完全或产生其他盐酸盐杂质，药物中的盐酸含量发生变化，即氯含量可能发生变化。 因此

10、，可以通过氯含量的测定来控制纯度。 含氟量氟尿嘧啶原料药中的氟化程度也可以通过含氟量来控制。 三、含量测定核酸类药物结构中的嘧啶碱和三氟甲磺酰氯碱具有一定的弱碱性，可以使用非水碱量法进行含量测定其共轭结构具有一定的紫外吸收，可以通过测定最大吸收波长的吸光度来测定含量，也可以使用带紫外检测器的法定量核酸系原料药的杂质少时，非水碱量法或紫外分光光度法可定量的杂质多时，需要有分离分析能力的高效液相色谱法。 (1)非水碱量法的原理核苷和碱衍生物等药物的碱性弱，在水溶液中进行酸滴定时没有明显的跳跃，难以得到满意的测定结果。 另一方面，冰醋酸溶剂中，弱碱性基团的相对碱强度显着增加，定量滴定在高氯酸滴定液中

11、，可以根据消耗的高氯酸滴定液的体积来修正这种药物的含量。 以更昔洛韦含量的测定为例，取本产品，精密测定，加入冰醋酸，加热溶解，放冷，加入结晶紫指示液滴，用高氯酸滴定液(.)滴定直至溶液变成绿色，用空白试验校正滴定结果。 高氯酸滴定液(.)相当于。 注意事项该方法准确度高，精密度好，广泛应用于弱碱性原料药的含量测定。 但是，这种方法影响因素很多，必须注意以下几点。 ()水分在冰醋酸中呈碱性，与高氯酸反应，因此反应体系中没有水分。 ()使用溶剂的冰醋酸是挥发性的，膨胀系数大，所以高氯酸滴定液的浓度受温度和贮藏条件的影响很大。 滴定时和标定时的温度差对高氯酸滴定液浓度的影响很大，一般的温度差小的情况

12、下，滴定液的浓度被校正，超过可用于定量修正计算的温度差时，请重新标定滴定液的浓度。 高氯酸滴定液的浓度校正公式如下：()冰醋酸溶剂的挥发、弱碱性杂质的存在可能会对测定结果产生干扰，因此该方法必须进行空白校正，即不加入供试品，用同样的方法操作，得到的结果必须扣除空白作为()终点的指示方法，经常使用电位滴定法和指示剂法，指示剂终点的颜色变化需要用电位滴定法来决定。 (二)紫外分光光度法的三氟代乙烷磺酰氯和嘧啶碱基除了可鉴别紫外吸收特性外，还可用于此类药物的含量测定。 中国药典(年版)收载的嘌呤、氟尿嘧啶和其他部位醇的原料药均采用紫外分光光度法吸收系数法测定含量。 (三)高效液相色谱大多数核酸类药物

13、可以通过通常的反相高效液相色谱进行分离测定，但部分结构中存在极性基团的核酸类药物通过通常的方法分离时，效果差，特殊的高效液相色谱，例如离子对色谱或离子交换色谱离子对色谱法核苷酸类药物的磷酸基多在反相高效液相色谱条件下以离子化状态存在，保留弱，不利于分离和测定。 离子对高效液相色谱法能有效改善核苷酸的色谱保持，实现准确的定量。 中国药典(年版)收载的环磷酸酶、三磷酸腺苷二钠和细胞磷酸酶均采用离子对色谱法测定含量。 离子对色谱在流动相中加入适量的反离子，与处于离解状态的被测定成分形成离子对，增加向无极性固定相的分配，改善色谱的保留和分离行为。由于核苷酸是酸性物质，因此其离子对可以是试剂中常用的季铵

14、盐阳离子试剂，如溴化四丁基、四丁基氢氧化铵。 离子对色谱的影响因素很多，需要慎重选择，包括对离子的性质和浓度、流动相的组成、值和离子强度等。 环磷酸酶的含量测定以：色谱条件和系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的磷酸二氢钾和溴化四丁基铵的混合溶液为流动相的检测波长为。 取环磷酸酶对照品约，加水溶解，加入盐酸溶液，水浴加热冷却，用氢氧化钠试验液调至中性，用水稀释，制成每天约含有的溶液，注入液相色谱仪，环磷酸酶峰和邻接杂质峰的分离度要求离子交换色谱核酸类药物结构包括含氮碱性基团、多羟基糖苷，部分以磷酸盐形式存在，这些基团与普通柱上的残留硅烷醇羟基氢键吸附，引起峰拖尾和柱压上升，不利于分离测

15、定。 利用这样的药物在适当的条件下可以离子化的性质，作为固定相填充剂使用离子交换树脂(例如磺化交联的苯乙烯乙烯共聚物)，通过离子交换原理进行分离，可以有效地改善拖尾问题。 中国药典从年版开始采用阳离子交换色谱法测定利巴韦林的含量，结果显着改善。 测定利巴韦林的含量色谱条件和系统适用性试验用的磺化交联苯乙烯乙烯共聚物的氢型阳离子交换树脂是以填充剂水(用稀硫酸调整值)为流动相的检测波长。 理论板数在利巴韦林峰进行了修正。 离子交换色谱法大多使用水缓冲溶液作为流动相，通过加入甲醇和乙醇等适量的有机溶剂提高分离度，改善试料的溶解度。 第三节应用实例一、嘌呤类似物为肌苷，通过抑制核酸合成发挥抗肿瘤作用。

16、 药用是含有结晶水的布丁。 本品主要通过化学合成法制造。 布丁主要以氰基乙酸乙酯为原料合成。 在加热的乙醇酐和乙醇钠溶液中，氰乙酸乙酯与硫脲结合生成巯基氨基羟基嘧啶，亚硝基化、还原除去巯基、二氨基羟基嘧啶，再合成甲酸环和羟基嘌呤，在吡啶溶液中合成五硫化二赖氨酸(1)鉴别()在本品中加入乙醇溶解后，与醋酸铅乙醇溶液反应，生成嘌呤铅黄色沉淀。 ()嘌呤分子上的巯基()与强氧化剂浓硝酸发生作用，被嘌呤亚磺酸氧化，进一步被氧化为黄色的嘌呤亚磺酸，进一步与氢氧化钠试验液反应，生成呈黄褐色的嘌呤亚磺酸钠。 ()嘌呤分子上的巯基()与氨试验液反应生成铵盐，溶解度增大，溶液变得澄清，与硝酸银试验液反应生成溶解

17、度小的嘌呤银白色的棉状沉淀，不溶于热硝酸。 ()本产品的红外光吸收图像必须与对照图像一致。 (二)检验.羟嘌呤羟基嘌呤是嘌呤的合成中间体，其结构与嘌呤只有一个取代基差异：一个为羟基取代，另一个为巯基取代。 精制不完全会残留，影响布丁的安全使用。 中国药典(年版)利用两者在紫外吸收图像上的差异，采用紫外可见分光光度法控制羟基嘌呤的量，由于嘌呤在场所有强的紫外吸收，而羟基嘌呤的最大吸收波长在场所几乎没有吸收，通过规定波长下的吸光度比，从而将羟基嘌呤的量硫酸盐本品在生产过程中可能产生硫酸盐杂质，中国药典(年版)在盐酸溶液中，不能与氯化钡反应引起混浊现象，控制硫酸盐杂质。.含有水分结晶水的药物需要测定水分，嘌呤水分的含量约为，中国药典(年版)规定使用费休法测定水分，含量如下。重金属嘌呤分子结构中含有可与重金属结合的巯基，如果用第一法进行重金属检查，就会产生假阴性的结果，因此，中国药典(年版)用第二法(炽热后的硫代乙酰胺法)检查嘌呤中的重金属。 该方法需要将试样在高温下烧制成无机物后再进行重金属检查