细胞毒性试验培训班用讲义.ppt

1、细胞毒性试验，2008-09-22，什么是细胞毒性试验？细胞毒性试验是一种体外试验，模拟体外生物的生长环境，检测医疗器械和材料与人体组织接触后的生物反应。它是医疗器械生物评价体系中最重要的检测指标之一，也是几乎所有医疗器械或材料临床应用前的必备项目。无论是国内外医疗器械的生物评价标准，细胞毒性试验都被列为第一项。细胞毒性试验的目的和意义。(1)目的：评估由医疗器械和材料引起的细胞毒性反应的可能性，并预测最终生物体应用时的组织-细胞反应。体外细胞培养技术可用于检测测试产品与细胞接触后细胞的生长抑制、功能变化、溶解、死亡或其他毒性反应。(2)意义：批量试验产品的细胞毒性可以在短时间内经济、简便地进

2、行筛选，这为体内方法(动物试验)提供了前提条件，也为新型医疗器械和生物材料的开发和应用提供了重要保障。1979年，美国国家标准局和牙科协会(ANSI/ADA41-1979)首次发布了口腔材料生物评价标准，规定测试样品的细胞毒性应采用51Cr标记法检测。1984年，国际标准化组织(ISO)发布的ISO/TR 740533601984推荐了三种测试方法：琼脂覆盖、分子过滤和51Cr标记。1989年，国际标准化组织专门成立了TC194技术委员会，制定了国际标准化组织10993系列医疗器械生物评价标准。在国际标准化组织10993-5: 1992中，提出了三种细胞毒性试验方法，即浸出液试验、直接接触试验

3、和间接接触试验。国内标准介绍，1987，卫生部标准WS5-1-1987医用热固性甲基乙烯基硅橡胶：琼脂覆盖法1996，GB/T16175-1996医用硅酮材料生物评价试验方法：细胞增殖法1997，卫生部第81号，生物材料和医疗器械生物评价技术要求：推荐琼脂覆盖、分子过滤和细胞生长抑制。1997年，GB/T 16886.5-1997采用国际标准ISO 1099有多少种细胞毒性试验方法？GB/T 16886.52003/ISO 10993-533601999推荐了三种类型的细胞毒性试验：1)浸出液试验2)直接接触试验3)间接接触试验(包括琼脂扩散试验和滤膜扩散试验)，常用的细胞毒性试验方法，1)浸

4、出液试验(MTT比色法或MTT法):哺乳动物细胞的线粒体酶能将黄绿色的MTT降解为蓝紫色的物质，这些物质溶于含有二甲基亚砜(DMSO)的溶液中，用微孔板读数器测量它们的浓度该试验用于细胞毒性的精细定量评估。干扰本测试的测试产品不适合本测试。2)间接接触试验：琼脂扩散法或琼脂覆盖法，哪些产品需要细胞毒性试验？与人体接触或植入人体的医疗器械需要进行细胞毒性测试。接触部位：1)表面：皮肤、粘膜、受损表面；2)外部通路：间接血液通路、组织/骨骼/牙齿、循环血液；3)体内植入：组织/骨、血液；试验材料：细胞系；建议使用ATCC CCL1(NCTC克隆929)小鼠成纤维细胞或ATCC CCL2 (Hela

5、)人上皮细胞。如果试验的可重复性和准确性能够得到证明，也可以选择其他细胞系。优选已建立的细胞系，并应从批准的来源获得。测试应该使用没有支原体污染的细胞。选择的细胞系和培养基用于制备实验所需的细胞。当使用冷冻细胞时，如果添加了细胞保护剂，在使用前应将其取出并至少传代培养一次。细胞复苏步骤，1)准备一杯40的温水。2)将细胞从液氮罐中取出，迅速放入温水中，摇匀使其溶解，并注意在半分钟内控制过程。3)离心，弃去上清液，加入新鲜培养基，接种到新的培养瓶中。试验材料：仪器、洁净工作台、CO2培养箱、冰箱、倒置光学显微镜、光学显微镜、蒸汽灭菌器、液氮瓶、吸滤瓶、电热恒温水浴罐、96孔培养板、可调微量取样器

6、、微孔板净水器、液氮罐、天平、离心机等。试验材料：消耗品、培养瓶、培养板、吸管、冷冻管、离心管、过滤器等。所有与试验物品接触的仪器应在压力蒸汽灭菌器中灭菌20分钟。试验材料：试剂、培养基(MEM、DMEM、IMEM、RPMI1640等)。)，血清(小牛血清、新生牛血清、胎牛血清、马血清等。)，消化液，左旋谷氨酰胺，抗生素溶液，碳酸氢钠溶液，二甲基亚砜和平衡盐溶液。含血清或无血清培养基应满足选定细胞系的生长要求。注：培养基中允许使用对试验无不利影响的抗生素。试验材料：试验溶液和对照品，试验溶液：样品浸出液应根据产品标准配制。阴性对照：未被证实产生细胞毒性反应的材料，如高密度聚乙烯。阳性对照：选择

7、已确认能重现细胞毒性反应的材料，如含有机锡添加剂的聚氯乙烯。测试步骤：MTT方法，a)培养细胞直到它们达到对数生长期的终点，用细胞消化液消化分散的细胞，并用细胞培养液制备1104细胞/毫升的细胞悬浮液。取一个96孔培养板，向每个孔中加入100升细胞悬液。轻轻水平旋转培养板，使细胞均匀分散在皿孔表面。b)将其放入含5个二氧化碳的二氧化碳培养箱中，在372培养24小时。测试步骤：MTT方法，c)丢弃原始培养基，并向每个孔中加入100L空白对照溶液、阴性对照溶液、阳性对照溶液、100和50浓度测试样品提取物。每组至少有8个孔。注：浸提原液或以培养基为稀释剂的系列浸提稀释剂。当使用0.9%氯化钠注射液

8、提取时，建议在稀释提取物时使用浓缩(如2或5倍)的介质。d)将含有5个二氧化碳的二氧化碳培养箱放在72下培养。培养间隔可分为24h、48h和72h。测试步骤：MTT方法，e)在每个培养间隔后，向每个孔中加入20l MTT溶液，将其置于含有5个二氧化碳的二氧化碳中，并在372下培养5小时。f)丢弃孔中的液体，向每个孔中加入200升二甲基亚砜，放置培养板10分钟，并水平摇动以使孔中溶液的颜色均匀。g)可以用微孔板读数器测量吸光度，选择的波长可以是570纳米和630纳米。测试步骤：MTT方法，h)结果计算：I)结果判断：根据RGR值，确定测试样品的细胞毒性。阴性对照组反应不超过1级。阳性对照组的反应

9、至少为3级。当反应不一致时，阴性对照组和阳性对照组应重新检测。1)以MMT方法为例：通常需要12周。注：所选细胞系和培养基用于制备实验所需的细胞。当使用冷冻细胞时，如果添加了细胞保护剂，在使用前应将其取出并至少传代培养一次。2)根据国家发展改革委和财政部文件(发展改革价格2003213)，细胞毒性试验的收费标准为2000元/项。YZB标准中的常见问题，没有指定使用什么方法进行测试。只写没有细胞毒性，没有等级要求。测试溶液没有浸出条件。有许多试验原理和体外细胞试验方法，每种方法都有自己的特点，因此很难在试验方法之间达成完全一致。因此，根据“最接近应用情况”的原则，在选择测试方法时，应尽可能合理地选择测试样品与细胞的接触方式和检测生物终点的评价方法。1.医疗器械监督管理条例(国务院令第276号)2 .条例：医疗器械生产监督管理办法(国务院令第12号)、医疗器械生产企业质量体系审查办法(国务院令第22号)、医疗器械分类规则(国务院令第15号)3。规范性文件：关于发布医疗器械注册产品编制标准相关标准的通知，1。行业标准YY/T0127.9口腔材料生物试验方法：细胞毒性试验(琼脂覆盖和分子过滤法)YY/T0268口腔用医疗器械生物相容性临床前评价单元1:评价和试验项目选择YY0325一次性无菌导管