SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE电泳,SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,实验目的,理解SDS-PAGE的基本原理 掌握SDS-PAGE技术,理解SDS-PAGE的基本原理 掌握SDS-PAGE技术,操作流程,制分离胶 制胶 制浓缩胶 破碎细菌，提取蛋白质 上样 电泳 凝胶染色 凝胶脱色,聚丙烯酰胺具有神经性毒性，可从皮 肤、呼吸道吸入，要做好防护措施。,制分离胶（每4人制一份）,10%分离胶配方（10ml可制1块胶） 按表中用量，在一个小烧杯里依次加入水，Acr/Bis，凝胶缓冲液，SDS，轻轻混匀； 加入

2、50uL 10% APS(过硫酸铵)，轻轻混匀；加入5uL TEMED（四甲基乙二胺），轻轻混匀； 用1ml移液器，将上述混合液加入制胶板中。注意，分离胶液面离玻璃板上沿约2cm（该空间用来制备浓缩胶），约3.3ml。 从胶板的左右两侧缓慢各加入200ul去离子水，使分离胶上表面覆盖一层水，以隔绝空气，加速胶的凝固。,灌 胶,SDS-PAGE电泳模具,螺栓,滑块,灌胶室（上槽）,玻璃板,旋钮,制胶架,下槽,上盖,步骤2：制胶,制浓缩胶（每4人制一份）,4%浓缩胶配方 待分离胶完全凝固（约30min，此时分离胶与水层有明显的分界线），倒掉水层，并用滤纸条吸干残余的水滴； 如上表所示，在一个小烧杯

3、里依次加入水，Acr/Bis，凝胶缓冲液，SDS，轻轻混匀； 加入50uL10% APS，轻轻混匀；加入10uL TEMED，轻轻混匀； 用1ml移液器，将上述混合液加入分离胶上层，插入梳子，室温放置约30-40min，待胶完全凝固。,破碎细菌，提取蛋白质（每人制1份）,从管中吸取1ml菌液，12000rpm 离心1min，弃上清，向沉淀中加入100ul PBS，涡旋震荡以充分悬浮细胞沉淀； 吸取10ul蛋白样，加入10ul 2loading Buffer，混匀（marker取5ul+ 10ul 2loading Buffer ，混匀），于95水浴加热15min。 12000rpm离心2min

4、，尽量取上清液待用。,上样,待凝胶完全凝固后，把凝胶固定架取出，垂直向上拔掉梳子。 取下固定架（绿色部分），把凝胶连同前后玻璃一起固定在电泳槽里。 向电泳槽加入1X电泳缓冲液至没过上样室。 上样：蛋白样约20ul （10ul蛋白样+10ul2loading Buffer， 混匀，点样。） marker约15ul （取5ulmarker + 10ul 2X loading Buffer，混匀， 点样。） 每人跑一份蛋白样；每排（6人）点一 块胶：每块胶最左边点一个蛋白marker。,电泳 先调100V/浓缩胶电泳，当指示染料进 入分离胶后，调至60V/分离胶，电泳至蓝色距 胶板下缘1cm为止。

5、染色 电泳结束后，取出凝胶室，用多用取胶器（钼红色标尺）撬开玻璃板取胶，剥离凝胶，去掉浓缩胶；将凝胶板浸入考马斯亮蓝染液摇床染色0.5-1h。 脱色 将已染色的凝胶板放入醋酸脱色液脱色1-2d，以背景无色为准。,试剂,用于制胶的试剂： 丙烯酰胺(Acr)、N，N一亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、过硫酸铵(APS)，四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠（SDS）、二巯基苏糖醇（DTT）。 缓冲液：Tris、HCl。 上样缓冲液：Tris、HCl、蔗糖、溴酚蓝、SDS 电泳缓冲液：Tris、甘氨酸。 染色剂：考马斯亮兰R250 浓度为2.5g/L，用甲醇醋酸蒸馏水=515的溶液配制（V/V）。

6、脱色剂：醋酸 取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。,各试剂的作用,Acr： Bis： Acr与Bis共同成为分子筛的主体。 APS：催化剂 TEMED：加速剂 在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 DTT：还原剂，使半胱氨酸的二硫键断裂并被还原。 SDS：为去污剂，断裂蛋白质的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构而去折叠成多肽。解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，从而消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。,甘氨酸：由于

7、pI=6.0,在pH=8.8是带负电，向正极泳动。因解离度小，有效迁移率很低，泳动慢。 HCl：强电解质，Cl-有效迁移率大，泳动快。因此，蛋白质的有效迁移率介于甘氨酸与Cl-之间。 考马斯亮蓝R-250：通过范德瓦尔键与蛋白质结合，它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，常用来对电泳条带染色。 醋酸：促凝胶脱去蓝色，使背景干净。,SDS-PAGE的实验原理,Acr与Bis在APS和TEMED作用下，形成分子筛，网孔径的大小决定于单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例。 SDS断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，DTT使半胱氨酸的二硫键断裂并被

8、还原，两者使蛋白质失去空间结构而成多肽链。SDS与蛋白质形成复合物（1g蛋白质与1.4g SDS结合），而SDS的负电荷大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，使复合物都带上相同密度的负电荷。SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质SDS复合物形成长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18埃，这样的蛋白质SDS复合物在凝,胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取 决于分子量的大小。由于蛋白质SDS复合物在单位长度上 带有相等的电荷，它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离 胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，蛋白质 大小

9、与泳动速率成反比。 当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。 蛋白质被考马斯亮蓝染成蓝色，醋酸脱去凝胶上的蓝色而使背景无色。,常用参数,T值：孔径大小取决于T，T值越大，孔径越小，机械性能越强。T是两个单体(单体丙烯酰胺和N-N-甲叉双丙烯酰胺)的总百分浓度： T=(a+b)/m（100%） 30%=（29g+1g）/100ml （a为单体丙烯酰胺的克数，b为N-N-甲叉双丙烯酰胺的克数，m为缓冲液终体积） C值：交联百分比浓度：C=b/(a+b) （100%） a，b的比例很关键，如果a:b 100，胶糊状。 一般有弹性，透明的胶，a:b比例应在30左右

10、,丙烯酰胺储存液的配制,29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N-亚甲双丙烯酰胺储存液： 丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。储于棕色瓶，4避光保存。 使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 注意聚丙烯酰胺具有神经性毒性，要做好防护措施。,通常丙烯酰胺的聚合有两种： 1：化学聚合 常用过硫酸铵，过硫酸钾来引发这个过程，用TEMED，三乙醇胺作为加速剂，这种引发-增速的催化系统是氧化-还原过程。当TEMED溶液中加入过硫酸铵后，过硫酸铵产生自由基，而丙烯酰胺和自由基作用活化，活化的烯酰胺形成多聚长链。 2：光聚合 光聚合的催化剂是核黄

11、素，在紫外线作用下，核黄素生成含自由基的产物，丙烯酰胺和自由基作用活化，活化的烯酰胺形成多聚长链。,丙烯酰胺的聚合方式,通常丙烯酰胺的聚合有两种： 1：化学聚合 常用过硫酸铵，过硫酸钾来引发这个过程，用TEMED，三乙醇胺作为加速剂，这种引发-增速的催化系统是氧化-还原过程。当TEMED溶液中加入过硫酸铵后，过硫酸铵产生自由基，而丙烯酰胺和自由基作用活化，活化的烯酰胺形成多聚长链。 2：光聚合 光聚合的催化剂是核黄素，在紫外线作用下，核黄素生成含自由基的产物，丙烯酰胺和自由基作用活化，活化的烯酰胺形成多聚长链。,分类,凝胶系统的均匀性： 连续性凝胶电泳 不连续凝胶电泳 按凝胶形状： 圆盘状电泳

12、 平板电泳 被分离的物质是否变性： 非变性、变性（SDS-PAGE）,连续系统和不连续系统,PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类， 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动主要依靠分子筛效应和浓缩效应，其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。,非变性胶,在聚丙烯酰胺凝胶中不加入SDS、DTT或尿素而制成的凝胶属于非变性胶。非变性胶中蛋白质迁移的速率不仅取决于蛋白质的大小，还包括其电荷或者形状。 分离的蛋白保留有天然蛋白质构象和生物活性。

13、,变性胶,变性胶是指在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠）、DTT（dithiothreitol，二硫苏糖醇）或尿素而制成的凝胶。 SDS能破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象；在包含有过量的SDS和巯基试剂的蛋白质样品，100加热时，二硫键被打开，蛋白质完全解离成它的亚单位。 由于高级结构的破坏，电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量。,提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径,1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。 2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，其中银染的分辨率最高。,电泳图,步骤5：染色、脱色和照相,电泳结束后，取出凝胶室，用多用取胶器（钼红色标尺）撬开玻璃板取胶，剥离凝胶，去掉浓缩胶; 染