《激光共聚焦简化》PPT课件.ppt

1、激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用，来滨，复旦大学上海医学院医学神经生物学国家重点实验室，显微镜，各种染色标记技术，荧光标记技术，优点：1.灵敏度高，比常规免疫组织化学灵敏度高1000倍。 2 .不同颜色的荧光标记可以清楚观察多种物质的共定位。 3 .能够观察活细胞中离子和蛋白质的动态变化，荧光显微镜、激光共聚扫描焦点显微镜、双光子激光扫描显微镜、荧光发生原理、荧光和荧光显微镜，一、荧光基础术语荧光物质：某些物质在特定波长范围的光线照射下，能够发出波长比照射光长的光线荧光受激发生荧光的物质称为荧光物质或荧光素激发光(EXCITATION ) :能够特异激发某荧光素的一定波长范围内的光线称为荧光素

2、的激发光。 激发/吸收光谱吸收峰(最大吸收波长)、发光光(EMISSION):发光光谱发光峰(最大发光波长)荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料、标记荧光素的特异性蛋白结合物(荧光抗体)自发荧光(auto fluorescence 埃文斯蓝、硼化氢钠处理漂白(BLEACH ) :荧光物质被激发时，发荧光的能力逐渐下降，最终漂白丢失。 二、荧光显微镜技术的基本原理、荧光显微镜、激发滤光器：从光源中分离出一定波长范围的激发光。 带通滤波器(BP ) :具有宽度、窄带的部分。 例如，BP450-490波长、短通滤色器组合(LP KP):LP450 KP490分色镜：分色镜； 反射短波长，透过长波长。

3、 阻断滤波器：长通滤波器多的LP490，普通荧光显微镜是宽视野显微镜，普通荧光显微镜是宽视野显微镜，荧光相互干涉图像的锐度降低，激发特性差的背景荧光高，蓝光(激发滤色器420-485 nm )的共焦点激光器LSFM )荧光显微镜系统，以激光为激发光源，采用检测光源针孔和针孔的共轭聚焦技术，对样品进行断层扫描，得到高分辨率的光学切片，共焦点系统细胞CT、共焦点激光扫描荧光显微镜的基本配置，、 不同波长的激光光源包括数字图像合成、激光扫描共焦显微镜与普通荧光显微镜的主要区别、光电倍增管、检测针孔、光源针孔、光源、分色镜、物镜、样品、聚光平面、激光扫描共焦显微镜的光学原理、荧光显微镜激光扫描共焦点显

4、微镜的应用领域，检测针孔和光源针孔的激光透过性强，使得在经常聚光的焦点平面以外激发的荧光不进入检测针孔的高分辨率的光学切片，对样品进行一定深度的光学断层，能够得到高标准的连续光学切片，实现三维重构形态学研究：凋亡、中枢神经系统的f相关、肿瘤细胞分类分子生物学：原位杂交、DNA、RNA定量、DNA损伤修复、外源基因在真核细胞中的表达、定位、荧光能量共振转移的大分子结构变化、受体与配体的相互作用活细胞动态荧光测定：细胞内Ca h等离子体的动态分布和动态定量、荧光漂白恢复细胞连接之间的信息传递直接生物组织或整体胚胎观察：单光子共聚焦激光扫描系统的界限：荧光漂白基本定量三维重组动态测定生物细胞或组织内

5、游离Ca2分布和浓度的变化测定(Mg2、Zn、Na、k )自由基的检测药物进入细胞的动态过程， 局部分布及定量蛋白质转位活细胞内h浓度(pH值)的测定线粒体膜电位的测定4 .荧光漂白恢复(FRAP )技术6 .荧光能量共振转移(FRET )技术1 .局部，荧光串扰， 根据荧光染料的性质可将荧光串扰分为两类：由于第一两类荧光染料的激发光谱不重叠，所以采用序列扫描的方法，用第一类荧光染料的激发光扫描一幅图像，然后用第二类荧光染料的激发光扫描第二幅图像第二种交叉颜色是两种荧光染料的发射光谱和吸收光谱重叠。 使用光谱扫描方法可以消除这些字符串颜色的影响。 关于分光扫描方法将在后面详细说明。 荧光色是指

6、两种以上荧光染料的发光光谱重合的现象，用多种荧光染料标记标本时，或者标本具有强自发荧光时，容易发生串色现象。 最简单的确定有无荧光串扰的方法是用单荧光标记的标本进行对照：首先观察第一种荧光色素单标记的标本，用第一种荧光色素的激发光，在第二种荧光色素的检测通道中观察有无荧光串扰，然后， 观察另一个仅标记有第二种荧光色素的标本，用第二种荧光色素的激发光在第一种色素检测通道上观察有无荧光串扰。 如果发现荧光串颜色，则可以使用序列扫描和光谱扫描的方法来消除串颜色的影响。 最简单的判断自发荧光有无的方法是使用与观察标记标本相同的仪器残奥仪观察未染色的对照标本。 为了尽可能地排除荧光串的颜色的影响，在实验

7、中，尽可能地选择发光光谱的重叠少的荧光染料，尽可能地选择吸收光谱的重叠少的荧光染料，使用只能激发一个染料的激光线扫描标本，进行序列扫描也就是说，一个颜色的目标不要过强或过弱，确保荧光信号比自发荧光强，顺序扫描的方法是排除荧光色，如图所示使用顺序扫描的方法排除荧光色的例子：用DAPI (蓝色)标记细胞核，用Cy2(蓝色)标记细胞核如果没有使用标记K ATPase和用Alexa 568 phallodin (红色)标记f的序列扫描，则DAPI信号连接到Cy2通道，Cy2信号连接到Alexa 569通道。 序列扫描中使用相同的样本可以清楚地分离所有颜色，从而消除荧光串色的影响。 z轴定位、x、y、z

8、、y、动态观察蛋白运输，首先染料的存在形式：根据荧光染料的存在形式可分为盐、甲基乙酸酯、葡聚糖等。 荧光染料的存在形态影响染料的搭载方式、染料在细胞内的分布、染料在细胞内的保持。 盐和葡聚糖形式的染料一般采用微电极注射的搭载方式。 以酯的形式存在的染料可以采用孵育的方法，将染料以浓度梯度被动地装载在细胞内，被细胞内的酯酶切断为细胞膜不透明的产物。测定活细胞内的离子动态变化，检测原理：游离Ca2变化的荧光探针多为Ca2螯合剂，通常不能透过细胞膜，只有与乙酰甲酯(AM )连接才能进入细胞内，与细胞内游离钙结合发出荧光。 活细胞内离子动态变化测定、细胞内游离Ca2测定、KCL诱导细胞外Ca2内流测定、培养/分离的细胞20M Fluo 3-AM负载液30-60min洗涤、液交换扫描、4 .荧光漂白恢复(fluorescence) FRAP检测细胞间的信息传递，光漂白技术的基本GFP是比较适合光漂白研究的荧光分子。 首先，比较明亮稳定，活细胞内没有毒性，用低激光强度拍摄图像时的漂白少。 其次，使用高强度激光照射时，GFP的光漂白是不可逆的，并且GFP的光漂白不造成细胞损伤。 分子融合技术将绿色荧光蛋白质与特定蛋白质分