第十六章 临床电泳分析仪器2012.ppt

1、第十六章 临床电泳分析仪器,最常见的电泳仪,该仪器开展的主要项目有: 1、 血清蛋白电泳 2、 CK同功酶 3 、CK同功酶亚型 4、 LDH同功酶 5、 AKP同功酶 6 、r-GT同功酶 7、 脂蛋白电泳 8、 血红蛋白电泳 9、 胆固醇电泳 10、结合珠蛋白电泳 11、免疫固定电泳 12、脑脊液蛋白电泳 13、尿液蛋白电泳,蛋白电泳氨基黑染色,胃肠道的蛋白丢失 各区带含量均减少，在各种胃肠道功能紊乱时，Alb丢失的同时也伴有球蛋白的丢失。常继发于狭窄性心包炎，先天性肠道林巴管扩张，肠道炎症等。,蛋白电泳丽春红染色,急性烧伤病人的电泳图谱,大面积烧伤病人,其图谱显示Alb、1、显著减少而2

2、明显增加.临床上产生低蛋白血症,其原因:一是血清渗出,二是皮肤丢失,急性肝脏疾病,电泳技术用途-分离、鉴定、纯化,在临床诊断中：血清蛋白，血红蛋白糖蛋白、脂蛋白的分离鉴定和含量的测定，还有血清酶以及免疫化学的检验。它为医生提供了诊断某些疾病的依据如肝炎，肾病等 在科研工作中主要用来提纯蛋白质和蛋白质的结构分析。 电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、无机离子等成分的分离和鉴定，甚至还用于细胞和病毒的研究。,电泳仪的定义 电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。 利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（

3、electrophoresis- technique ）。 可以实现电泳分离技术的仪器称之为电泳仪（electrophoresister) ；,第一节 电泳原理 一、电泳的基本原理 物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相 等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场 中它们的移动方向和移 动速度也不同，因此可 使它们分离。,蛋白质电泳动画.swf,若溶液里一电量为q的带电粒子，在场强为E的电场中以速度v移动，则它所受到的电场力F1应为： F1 =QE 根据斯托克司定

4、律，在液体中泳动的球状粒子所受到的阻力F2 ，为： F2=6RV 式中为介质的粘度系数，R为粒子半径。 当二力平衡，即F1 = F2时，粒子作匀速运动。且有 V=QE/6r 从上式可以看出移动速度不仅与本身性质有关，还受到外界因素的影响,影响电泳的因素,（一）电场强度 （二）溶液的pH值 （三）溶液的离子强度 （四）电渗作用 （五）粒子的迁移率 （六）吸附作用,一般来说，不同成分的物质，其颗粒本身所带的电量以及颗粒的半径(或摩擦系数)都是不同的，所以它们的迁移率各不相同。利用这一原理即可把物质中各种不同的成分分离开来。例如，血清蛋白中含有各种蛋白质(清蛋白、1, 2 ,球蛋白等)，,电泳分析技

5、术的分类,1、根据电泳电压的高低 常压电泳 高压电泳 2、根据电泳中是否使用支持物 自由电泳:在自由溶液中进行的电泳方法 区带电泳:更常用的电泳是将试样放在支持介质（载体）上进行泳动，并在支持介质上形成一个个区带,3、按支持物的物理性状不同,纸电泳 纤维薄膜电泳 如醋酸纤维素电泳 凝胶电泳 如琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳,4、按支持物的装置形式不同：,平板式电泳 垂直板式电泳 垂直柱式电泳,电泳分析仪可分为两大类: 临床实验室常规类,如全自动荧光/可见光双系统电泳仪、全自动醋纤膜电泳仪、全自动琼脂糖电泳仪; 科研为主兼做临床样本类,如双向电泳及双向电泳,液相色谱-质谱联用、高效毛细管电泳及高效毛

6、细管电泳-质谱联用、高效毛细管芯片电泳、DNA测序系统。,从目前临床 实验室的要求来看电泳仪必须具有下列功能： 1.全自动，必须达到人员离机作业，由点样到出报告没有人工动作。 2.速度快，所有项目应在60min内完成，同时具备急诊项目，如CK、LD等同工酶及亚型项目。 3.项目全，除了血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、CK、LD同工酶等传统项目外，必须还能完成尿蛋白、脑脊液蛋白、免疫固定(单克隆抗体)，碱性磷酸酶(ALP)和s谷氨酰转肽酶(GGT)同工酶、胆固醇(高密度、极低密度低密度脂蛋白)、脂蛋白(a)等最新检验项目。 4.灵敏度高，必须采用敏感度高的电泳片，如琼脂糖凝胶系统，才能得到准确度高、

7、分辨率高的电泳结果,第二节 常用电泳技术和电泳方法,一、电泳方法简介 （一）纸电泳 指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。,06-02 平卧式电泳槽装置示意图,将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压（100V1000V）进行电泳。,（二）醋酸纤维素薄膜电泳 电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、 电泳时间短、样品 用量少。因此特别 适合于病理情况下 微量异常蛋白的检测。,06-03 血清蛋白的电泳图谱,醋酸纤维素薄膜电泳分

8、离血清清蛋白,（三）凝胶电泳 由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖。 它具有机械强度好、 弹性大、透明、化学稳定性高、 无电渗作用、设备简单、 样品量小(1100g）、 分辨率高等优点。这种介质 具有分子筛的作用,06-04 凝胶电泳图,琼脂糖电泳检测,聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用 聚丙烯酰胺具有许多优点: 如具有化学惰性；不与试样或其他化学成分起反应；在电泳过程中没有电渗作用和吸附作用； 弹性强，机械强度高；便于操作；透明，便于肉眼观察和用仪器测定；重复性好等。 因此聚丙

9、烯酰胺凝胶电泳目前得到广泛应用，如用于蛋白质、核酸等不同大小分子物质的分离和分析。也可测定蛋白质亚基的摩尔质量。可直接应用于临床医学检验中，如测定脑脊液、血、尿、痰和其他体液中的痕量成分。目前多用于离血清蛋白、病毒、酶蛋白等。还可用于分离痕量的蛋白质，,尿蛋白电泳及图谱,（四）等电聚焦电泳 1 等电聚焦电泳过程 一种利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH值梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH值位置上，最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带。,06-05 净电荷与PH的关系曲

10、线,等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。,2等电聚焦电泳的特点 使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度； 由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面； 电泳速度快; 分辨率高; 加入样品的位置可任意选择； 可用于测定蛋白质类物质的等电点; 适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。,（五）等速电泳 采用两种不同浓度的电解质组成，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。前

11、导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解 质之间的空隙中移动， 实现分离。,06-06 等速电泳示意图,（六）双向凝胶电泳（二维电泳） 第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。 第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状 。,胶性 PH9 中电 加解 入质 了溶 双液 PH3,加上电场后建立稳定PH梯度,蛋白质溶液加入，建立电场,染色后

12、，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开,第一向 等电聚焦,PI逐渐降低,等电聚焦胶放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上,第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量逐渐降低,PI 逐渐降低,06-07 双向凝胶电泳示意图,(七）免疫电泳 免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。,临床上常用的电泳方法有哪些？p212,第三节 常用电泳设备的基本结构及技术指标,一、常用电泳设备的基本结构 （一）电泳电源

13、（二）电泳槽 （三）附加装置,06-08 平卧式电泳槽装置示意图,电源,各种电泳槽,附加装置,电泳条带的分析装备,电泳条带的分析装备 习惯上，电泳分离后每一片段结果以百分率报告；假如已知总含量，还可以报告计算得到的定量结果。可将电泳片段洗脱后，用分光光度计测定洗脱液；也可用其他分析装备直接对电泳结果进行扫描分析。 1光密度扫描仪 光密度扫描仪可对电泳结果直接进行扫描，从而得出相对百分比甚至可以绘制出曲线图，计算出相对面积。 光密度扫描仪的主要特性有： 可扫描的电泳支持物长度为25150mm。 可按指令设置对照。 可自动去除一定程度的背景色(设置“基线”)。 有多个波长可选择用于测定(分光计或滤

14、光片),分辨率高 有汇集、处理数据的功能。 由计算机控制的先进的自动电泳仪器所配备的光密度扫描仪可以分析多达约30种不 同的电泳条带，有的还可采用荧光法分析电泳条带，这在分析某些同工酶(如CK同工酶等)时十分有用。此外，先进的光密度扫描仪还设计有可供选用的包括自动扫描在内的多种扫描方式和打印装置等，并有质量控制和统计功能，结果可储存和传输。,2其他常用的电泳图谱分析设备 紫外透射反射仪：需在暗室内使用。用于对核酸 片段进行观察。一般入射光为300nm，反射光为254nm和365nm。还有使用方便的手提式紫外反射仪。 双光观察照相仪：可毋需在暗室内操作，对核酸、同工酶和蛋白质的电泳片段进行观察分

15、析和照相记录；254nm、300nm和365nm3个波长可任意选择和组合，使用方便。 照相设备：要求使用分辨力高的照相机和胶卷，并使用聚焦镜头或近拍器。有时还需根据电泳凝胶的颜色，加用不同的滤光片。,3、电泳所需的常用材料 (一)电泳支持物 电泳支持物可分为两类。一类支持物包括滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂、琼脂糖等 (二)缓冲液 电泳缓冲液中的离子有两个作用：一是使电流得以流动，二是维持一定的pH (三)加样器 电泳时加入的样品量应能满足电泳分离要求 (四)染料 电泳后可用某种染料对已分离的蛋白质组分进行染色，使之固定并成为肉眼可见的条带。根据支持物或检测需要不同可选择不同染料。常用于蛋白质染色的

16、染料有氨基黑，丽春红，或溴酚蓝。,二、电泳仪的主要技术指标 1 输出电压 8 连续工作时间 2 输出电流 9 保护措施 3 输出功率 10 显示方式 4 电压稳定度 11 定时方式 5 电流稳定度 12 电源电压 6 功率稳定度 13 电源频率 7 输出组数 14 功耗,使用方法及注意事项 1，使用前应首先阅读仪器说明书，熟悉该机面板上的各旋钮的功能。 2连接好电泳槽与电泳仪的连接导线，电源开关置于关闭状态，将调节旋钮逆时针旋到最小值处；稳压稳流选择开关放置在所需要的工作位置。 3该机的输出电压和电流均分为两档，选择好档位后，输出范围和电表指示同时转换。 4开机后旋转输出调节旋钮，将电压或电流

17、调至所需要的数值。 。,5当使用两个电泳槽时，电压表显示的是加在每个电泳梢两端的电压，电流表指示的是两电泳槽电流之和。 6该机设有自动短路保护装置，当输出发生短路时，仪器停止工作3s，然后会自动启 动 7不应将电泳槽放在电源装置上进行电泳。开机后人体不能与电泳槽中的溶液接触；维护、检修时，应先切断电源，以确保安全。,电泳仪的维护与保养 (1)变换极性应在关机条件下进行。 (2)仪器处于稳流工作状态时，勿使输出开路(即不接电泳槽或导线松脱)，稳流工作输 出开路的特征是电流表指示为零而电压表指示超出刻度范围。短时间输出开路仪器不会损 坏，但长时间开路会使电压表发热过度。 (3)仪器在使用中严禁溅人

18、电解质溶液，不得将电泳槽放在电泳仪上进行实验工作。,如溶液已进入电泳仪，切勿接通电源，以免造成事故。同时应由专业人员修理后才可使用。 (4)仪器工作时，因电压较高，开机后人体不宜与电泳槽中溶液接触，最好关机后再看样品，以免触电。 (5)切勿在空载情况下开机，否则会造成人为故障。 (6)使用中发现异常现象时应立即切断电源，进行检修。,第五节 毛细管电泳,一、毛细管电泳的基本工作原理 溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异 而实现分离。,毛细管电泳的基本结构和分离模式,06-09 毛细管电泳仪装置示

19、意图,二、毛细管电泳的特点 1. 高灵敏度 2. 高速度 3. 高分辨率 4. 样品少 5. 自动化程度高 6. 应用范围广,06-10 英特雷勃 全自动电泳仪,三、毛细管电泳的分离模式 （一）毛细管区带电泳 它是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下，依迁移速度的不同而进行分离的。根据组分的迁移时间 进行定性，根据电泳峰 的峰面积或峰高进行定 量分析。,06-11 毛细血管区带电泳原理图,（二）毛细管凝胶电泳 将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，能根据待测组分的质荷比和分子体积的不同而进行分离。 适用于分离、测定肽类、蛋

20、白质、DNA类物质的分离。,（三）毛细管胶束电动色谱(MECC) 使MECC系统中存在两个相：流动的水相和起到固定相作用的胶束相。在含有胶束的流动相中，溶质在“水相”和“胶束相”(准固定相)之间进行分配，即使是中性溶质，因其本身疏水性不同，在二者之间的分 配也会有差异，疏水性强的溶质在“胶束相”中停留时间长，迁移速度就慢。反之，亲水性强的溶质迁移速度就快，最终中性溶质将依其疏水性不同而得以分离。,（四）毛细管等电聚焦电泳 不同等电点的分子分别聚集在不同的位置上，不作迁移而彼此分离，这就是等电聚焦分离过程。毛细管的等电聚焦是在毛细管内实现的等电聚焦过程，具有极高的分辨率，通常可以分离等电点差异小

21、于 0.01pH单位的两种蛋白质，例如肽类、蛋白质的分离。,（五）毛细管等速电泳 毛细管内首先导入具有比被分离各组分高电泳淌度的前导电解质，然后进样，随后再导入比各分离组份低电泳淌度的尾随电解质，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中发生分离。,（六）毛细管电色谱 它包含了电泳和色谱两种机制，是在毛细管中填充 或在毛细管壁 上键合（或涂壁）固 定相，从而构成毛细 管色谱柱，依靠电渗 流推动流动相，携带 样品迁移，根据样品 分子的质荷比、分子 尺寸及分配系数的差 别而分离。,06-13 CEC-加压毛细管电色谱仪,四、毛细管电泳仪的基本结构 毛细管电泳仪的结构并不复杂

22、，主要有高压源、毛细管柱、检测器，以及两 个供毛细管两端插入而又可 和电源相连的缓冲液槽。 （一）毛细管柱 （二）检测器 （三）毛细管电泳 法的进样技术,06-14毛细管电泳仪,六、常用各种电泳仪简介 （一）稳压稳流电泳仪 稳压稳流电泳仪是中压电泳仪。其输出电压的调节范围为0V600V、输出电流为0mA100mA。该机工作稳定性好、调节范围宽，并设有完善的短路保护电路和过流保护电路，是目前国内中、低压电泳实验中应用最广泛的电泳仪之一。,06-15 稳压稳流电泳仪,（二）全自动醋纤膜电泳仪 全自动醋纤膜电泳仪为全自动电泳仪，有可见光单系统，使用醋酸纤维薄膜电泳片，优点为自动化程度高。只需将样品、

23、试剂、电泳片放好，人员可离机完成实验并得到结果。 （三）全自动荧光/可见光双系统电泳仪 全自动荧光/可见光双系统电泳仪为全自动电泳仪，具有荧光/可见光双系统，在使用荧光试剂项目如CK、LD同工酶时为全自动。只需将样品、试剂、琼脂糖凝胶电泳胶片放好后，操作人员可离机完成实验并得到结果,（四）全自动琼脂糖电泳仪 全自动电泳仪，有可见光单系统，使用琼脂糖凝胶电泳胶片，优点为灵敏度高，可适用于低浓度蛋白检验 。该仪器自动化程度较差，当电泳结束和染色脱色完成后，工作人员必须将电泳片由机器中取出。,（五）双向电泳及双向电泳-液相色谱-质谱联用 双向电泳是将样品进行电泳后，在它的直角方向再进行一次电泳。双向

24、电泳第一向为等电聚焦，第二向为梯度SDS电泳。样品经过电荷与质量两次分离后可得到分子的等电点、分子量等信息。这是目前所有电泳技术中分辨率最高，信息量最多的技术，已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具。,（六）高效毛细管电泳及高效毛细管电泳-质谱联用 高效毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为推动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。高效毛细管电泳是一种迅速发展的分离技术，仪器简单、操作简便、分析速度快、分离效率高、操作模式多、开发分析方法容易、实验成本低、消耗少、应用范围极广。,（七）毛细管电泳芯片 利用毛细管电泳芯片可以进行DNA长度分析、序列分析和基因分型等研究。是利用芯片分离荧光标记的寡核苷酸，整个分离过程在45s之内，而芯片的长度仅为3.8cm。因为其可承载高电压（2300V/cm）并具有较小的样品体积，故有利于得到较好的分离效果。,（八）DNA测序系统 该系统利用凝胶毛细管的原理，将多道毛细管阵列设计，用四种不同的荧光染色标记4种核苷酸，在模板上合成DNA单链，然后在DNA外切酶的作用下进行碱基的连续水解和释放，用激光识别和记录释放的碱基。,06-16 DNA测序系统,第五节 电泳仪的临床应用,一、 血清蛋白电泳 新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色后，通