基因工程的工具——酶与载体

1、基因工程及其应用,假定你是一位知名的育种专家，某动物园为了迎合观众猎奇的心理，想请你为他们培育出下面几只“怪物”，请问你准备用什么方法？,怪物 1,怪物 2,怪物 3,怪物 4,传统的育种方法能否实现？,这就要用到定向改造生物的新技术 基因工程,基因工程：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,原理：,操作水平：,结 果：,一、基因工程,基因重组,DNA分子水平,定向地改造生物的遗传性状，获得人 类所需要的品种。,为什么能把人的基因“嫁接”到细菌上并成功表达？,1、大多

2、数生物的遗传物质都是DNA，且主要为双螺旋结构，即不同生物的DNA分子基本结构是相同的，都遵循碱基互补配对原则 。所以不同的生物DNA可以嫁接 2、地球上的所有生物共用一套遗传密码，所以，一种生物的基因可以在另外一种生物体内得以表达,DNA重组技术的基本工具,准确切割DNA的工具（“分子手术刀”） 限制性内切酶 DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） DNA连接酶 基因转移工具（“分子运输车”） 基因进入受体细胞的载体,基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：,“分子手术刀”限制性核酸内切酶（简称限制酶）,（二）基因操作的

3、工具,即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。,特 点：,存在原核生物 (主要是微生物)体内。,这类酶存在于原核生物中有什么作用呢？,切割外源DNA，使之失效，达到保护自身的目的。,专一性,限制酶,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,（二）基因操作的工具,限制酶,什么叫黏性末端？,（二）基因操作的工具,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,限制性内切酶,1.特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，在特定的切点切割。 2

4、.分布：主要在微生物中。 3.结果：产生黏性末端（碱基互补配对）、平末端。 4.举例：大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端，Sma能识别CCCGGG序列，并在 C 和G之间切割形成平末端 。,GAATTCCGTAGAATTCGGATT,尝试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端,CTTCATGAATTCCCTAA,GAAGTACTTAAGGGATT,CTTAAGGCATCTTAAGCCTAA,练一练:,目的基因,被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？,思考:,要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末

5、端？一个目的基因有几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。,是，会产生相同的黏性末端。,DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制酶切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。,是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?,基因的针线：DNA连接酶,、基因的针线DNA连接酶,连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。,A,A,T,T,G,C,C,T,T,A,A,G,连接磷酸二酯键,不同点 连接酶的作用是：将DNA片段间互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。,DNA

6、聚合酶和DNA连接酶有何相同和不同点？,聚合酶：以一条DNA为模板，将一个一个核苷酸连接起来,相同点：都是通过形成磷酸二酯键连接起来,基因进入受体细胞的载体,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。,（一）作用：,将外源基因送入受体细胞。,运载体,质粒、噬菌体和动植物病毒,1.假如目的基因导入受体细胞不能复制将怎样？ 2.作为载体没有切割位点（即限制酶切点），将会怎样？ 3.目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？ 4.如果载体对受体细胞有害将会怎样？,（二）.种类： （三）.质粒的特点,作为运载体需要什

7、么条件吗？,最常用的运载体质粒,分布：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中。,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。,本质：细胞染色体(或拟核)外能自主复制的小型 环状DNA分子。,质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。,基因的运输工具质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。,作为运载体必须具备哪些条件？,1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2.具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3.具有某些标记基因，便于进行筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。 4.对受体细胞无害。,基因工程的基本操作

8、程序主要包括 四个基本步骤：,1）目的基因的获取 2）基因表达载体的构建 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测与鉴定,步骤一：目的基因的获取,目的基因是人们所需要转移或改造的基因, 获取目的基因是实施基因工程的第一步 。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成

9、RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。,启动子,补：真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能

10、编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,请阅读P9第一和二两段,(一)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的

11、不同基因，称为基因文库,1.基因文库,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,目的基因的提取方法,直接分离基因 人工合成基因,反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA,：鸟枪法,鸟枪法：,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,与载体连接 载入,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(直接分离法),1、直接分离基因,1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),双链DNA (即目的基因),反转录

12、,合成,2.人工合成基因法,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不

13、行吗?,哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？,1）DNA序列自动测序仪： 2）PCR技术：,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,(二)利用PCR技术扩增目的基因, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、 _、_ (做启动子)、 _.前提条件：,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,选修1 P60,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(二)利用PCR技术扩增

14、目的基因,过程：,a、DNA变性（90-96）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性25-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。,(二)基因表达载体的构建, 核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,质粒

15、,DNA分子,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）, 核心,同一种,(二)基因表达载体的构建,4.过程:,5.基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们有什么作用？,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞,(三)将目的基因导入受体细胞,转化 ,方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法

16、,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法 （1）农杆菌介绍 （2）原理及适用范围,(三)将目的基因导入受体细胞,2、将目的基因导入动物细胞 （1）方法：显微注射法 （2）程序：,(三)将目的基因导入受体细胞,3、将目的基因导入微生物细胞 （1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？ （2）方法：,4、目的基因的检测和鉴定,大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。 将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物

17、的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（DNA-RNA杂交）,抗原抗体杂交,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,二、基因工程的应用,一、植物基因工程硕果累累,一、基因工程

18、与作物育种,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面.,利用转基因改良植物的品质,1、繁殖具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质量的皮毛等优良品质的转基因动物。,二、基因工程在畜牧养殖业上的应用,将人的生长激素基因和牛的生长激素基因分别注射到小白鼠受精卵中，得到的“超级小鼠”。,生长快、肉质好的转基因鲤鱼(中国),超级羊,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),2、利用某些特定的外源基因在哺乳动物体内表达，从这些动物的乳腺细胞中生产药物，如激素、抗体及酶类等。,基因工程在畜牧养殖业上的应用,3.用转基因的动物作器官移植

19、的供体,导入人基因具特殊用途的猪,背上长人耳的老鼠,三、基因工程与药物研制,我国生产的部分基因工程疫苗和药物,许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。,微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。,生产基因工程药品,胰岛素治疗糖尿病的特效药。,干扰素抗病毒的特效药。,人造血液及其生产,我国生产的部分基因工程疫苗和药物,白细胞介素、溶血栓剂、凝血因子、人造血液代用品,疫苗： 乙肝、狂犬病、百日咳、霍乱、伤寒、疟疾,基因工程药品,基因诊断：,也称为DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。,基因治疗曙光初照,是指是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。,基因治疗：,基因工程与环境保护,环境监测： 检测环境中的病毒、细菌等污染。,用DNA探针可以检测饮用水中病毒的含量。 1t水中有10个病毒也能被检测出来,快速灵敏