反转录病毒 ppt课件

1、逆转录病毒 Retroviruses,1,PPT学习交流,逆转录病毒（Retroviruses）归类于逆转录病毒科，包括一大类含有逆转录酶的RNA病毒，分为肿瘤病毒亚科（Oncovirinae）、慢病毒亚科 （Lentivirinae）和 泡沫病毒亚科 （Spumavirinae），每一亚科又有若干个属。,2,PPT学习交流,逆转录病毒的分类,3,PPT学习交流,逆转录病毒共同的生物学特性： 病毒呈球形，有包膜，直径80120nm。 病毒基因组由两条相同的单正链RNA形成的二聚体组成。 病毒的核心含有逆转录酶、RNA水解酶和整合酶。 复制有一个独特的逆转录和与宿主细胞的整合过程，病毒基因组RN

2、A先逆转录成双链DNA，然后整合到宿主细胞的染色体DNA中。 具有gag、pol和env 3个结构基因。,4,PPT学习交流,第一节 人类免疫缺陷病毒 1981年美国疾病控制中心科学家发现获得性免疫缺陷综合症。 1983年法国巴斯德研究所Montagnier等首次从一例慢性淋巴腺病的男性同性恋病人血液中分离到的一株新逆转录病毒，称为淋巴腺病相关病毒(LAV)。 1984年，美国Gallo等亦从艾滋病人中分离到相似的逆转录病毒，称之为人类嗜T淋巴细胞病毒型 (HTLV- )。 1986年，国际病毒分类委员会将LAV 、 HTLV- 统一命名为人类免疫缺陷病毒（human immunodefici

3、ency virus, HIV）。,5,PPT学习交流,HIV是获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS）的病原体。HIV分HIV-1型和HIV -2型，前者引起全球AIDS流行，后者主要分离自西部非洲的艾滋病患者。 我国自1985年发现首例AIDS以来，感染人数逐年快速增长。,6,PPT学习交流,根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性，HIV-1型又进一步分为3个组，M亚型组（main即主要组）、O亚型组（outline即外围组）和N亚型组（new，or non-M，non-O新组或非M非O组）。 其中M

4、组有A，B，C，D，E，F，G，H，I，J，K11个亚型。O组是1990年从喀麦隆和加蓬分离到的，与M组其他亚型的氨基酸序列只有50%的同源性。N组是最近才从两名喀麦隆病人分离到的，在系统树上，既不属于M组，也不属于O组的一组新病毒，故称N组。,7,PPT学习交流,不同组甚至不同亚型在全球流行是不均一的。HIV-1的O组、N组和HIV-2型只局限在非洲某些局部地区流行。而HIV-1的M组病毒呈全球性流行。到目前为止，全球流行的绝大多数毒株是HIV-1M组中的A、C亚型毒株，接着是B亚型毒株，然后是A/E和A/G亚型重组毒株。进一步的分子流行病调查表明，在非洲几乎流行了HIV的所有亚型，但以A和

5、C亚型为主，,8,PPT学习交流,HIV1型 M亚型组A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K共11个亚型 O亚型组 N亚型组 HIV2型 A、B、C、D、E、F、G共7个亚型,9,PPT学习交流,一、生物学性状 HIV为20面体对称结构、球形，电镜下可见一致密圆锥状核心，内有病毒RNA分子和酶（逆转录酶、整合酶和蛋白酶）。HIV的最外层为脂蛋白包膜，膜上有表面蛋白（gp120）和镶嵌蛋白（gp41）两种糖蛋白，gp120为刺突，gp41为跨膜蛋白。包膜内面为P17构成的基质蛋白，其内为衣壳蛋白（P24）包裹的RNA。,10,PPT学习交流,HIV结构模式图,11,PPT学习交流,HIV基因

6、组由两个拷贝的正链单股RNA组成，在其5端可通过氢键结合构成二聚体。HIV的基因组成较其他逆转录病毒复杂，全长约9.2kb，含有gag、pol和env三个结构基因，以及tat、rev、nef、vif、vpr和vpu 等调控基因。,12,PPT学习交流,HIV的复制过程： 首先借助其包膜糖蛋白刺突gp120，与易感细胞表面的CD4分子结合并进一步介导包膜与宿主细胞膜的融合，核衣壳进入细胞，于胞质内脱壳释放出RNA。,13,PPT学习交流,HIV - Life History,Entry into the cell T4 (CD4+) cells are major target,Human He

7、La Cell,Human HeLa Cell transfected with CD4 antigen,NOT INFECTED,INFECTED,14,PPT学习交流,CD4+ cell,HIV gp120 binds to CD4 / co-receptor,15,PPT学习交流,HIV - Life History,CD4,CD4,CD4,HIV,CCR5,CCR5,chemokine,Mutant CCR5,macrophage,16,PPT学习交流,HIV复制：在病毒逆转录酶和病毒体相关的DNA多聚酶的作用下，病毒RNA先逆转录成cDNA，构成RNA-DNA中间体。其中的RNA再经

8、RNA酶H水解，而以剩下的负链DNA复制成双股DNA。插入宿主DNA，成为细胞染色体的一部分，即前病毒。 当前病毒活化，在宿主RNA聚合酶的作用下，病毒的DNA转录为RNA并分别经拼接、加帽或加尾形成HIV的mRNA或子代病毒RNA，mRNA在宿主细胞核糖体上翻译蛋白质。子代RNA则与病毒结构蛋白装配成核衣壳，从宿主细胞释出时获得包膜，成为具有感染性的子代病毒。,17,PPT学习交流,18,PPT学习交流,HIV的变异 HIV具有高度变异性，主要取决于env、nef、ltr及pol等基因。不同病毒株间在上述基因的变异率各不相同。env基因编码包膜糖蛋白抗原，此类抗原的变异与HIV的流行和逃避宿

9、主的免疫应答密切相关。根据env基因序列的不同，将国际上流行的HIV-1分为M、N和O群，其中M又有AK等11个亚型之分。,19,PPT学习交流,培养特性 在体外，HIV只感染CD4+T细胞和巨噬细胞，新鲜分离的正常人T细胞，病人自身分离的T细胞培养或某些T细胞株。感染后细胞出现不同程度的病变，培养液中可测到逆转录酶活性，而培养细胞中可查到病毒的抗原。 动物接种：恒河猴、黑猩猩。,20,PPT学习交流,二、致病性与免疫性 1. 传染源： HIV携带者和艾滋病患者 2. 传播途径 性接触传播 输血或血制品传播 母-婴垂直传播,21,PPT学习交流,3. 致病机制 （1）损伤CD4 +细胞 以CD

10、4 +细胞为中心的免疫功能全面障碍； 其他细胞损伤，如单核-巨噬细胞、小神经胶质细胞等。 （2）其他免疫细胞功能异常：CD4 +细胞是重要的免疫调节细胞，其数量和功能的改变都将影响其他免疫细胞的状态。 （3）HIV具有高度变异性，影响机体抗感染免疫和疫苗的研究。,22,PPT学习交流,1. PUNCTURED MEMBRANE,1. 病毒增殖导致胞膜通透性增加,23,PPT学习交流,Uninfected CD4 cell gp120 negative,Cells Fuse,2. 形成多核巨细胞而导致细胞死亡,Infected CD4 cell gp120 positive,Why do all

11、 T4 cells disappear?,24,PPT学习交流,3. 损伤CD4 T细胞,Why do all T4 cells disappear?,25,PPT学习交流,4. 临床特征 （1）原发感染急性期 （2）无症状潜伏期 （3）AIDS相关综合征期 （4）典型AIDS期：AIDS的诊断标准已由CDC确定,26,PPT学习交流,感染艾滋病毒的早期症状 1.艾滋病一般性症状 持续发烧、盗汗、虚弱、全身浅表淋巴结肿大，体重下降在三个月之内可达10%以上，最多可降低40%，病人消瘦特别明显。2.消化道症状 食欲下降、厌食、恶心、呕吐、腹泻、严重时可便血。通常用于治疗消化道感染的药物对这种腹泻

12、无效。3.神经系统症状 头晕、头痛、反应迟钝、智力减退、精神异常、抽风、偏瘫、痴呆等。4.皮肤和粘膜损害 弥漫性丘疹、带状疱疹、口腔和咽部粘膜炎症及溃烂。 5.肿瘤 可出现多种恶性肿瘤，位于体表的卡波希氏肉瘤可见红色或紫红色的斑疹、丘疹和浸润性肿块。,27,PPT学习交流,因此建议在高危行为的6周或三个月后去做HIV抗体检测，只有在艾滋病病毒感染的潜伏期，发现艾滋病病毒感染才有可能治疗并控制病情发展，否则一旦发展为艾滋病病人，就很难挽回了。,28,PPT学习交流,CD4细胞/l,1000 500 250 200 100 0,4 10 15 年,500 250 250 100,淋巴结肿 口腔白斑

13、 白色念珠菌感染 带状疱疹 结核 PcP Kaposi肉瘤 消耗病 弓形体病 CMV感染 非典型分枝杆菌 淋巴瘤,CD4+T细胞进行性下降与并发症之间的关系,29,PPT学习交流,5. 免疫性 在HIV感染过程中，机体可产生高效价的抗HIV多种蛋白的抗体，包括抗gp120的中和抗体。这些抗体主要在急性期降低血清中的病毒抗原数量，但不能清除细胞内病毒，HIV感染也可引起细胞免疫应答，包括特异性CTL和非特异性NK细胞的杀伤作用，其中CTL对HIV感染细胞的杀伤十分重要，但也不能彻底清除潜伏感染的病毒。,30,PPT学习交流,三、微生物学检查法 1. 检测特异性抗体 检查血清中抗gp120的抗体，

14、可用ELISA、IFA、RIA，适用于筛查（HIV的gpl20与淋巴细胞膜上的MHC-类分子有同源区，所以会出现假阳性反应）。检出阳性标本，再用蛋白印迹法（western blot test） 等方法复核确诊。 2. 病毒分离培养 敏感细胞有T淋巴细胞株、新鲜分离的正常人淋巴细胞。,31,PPT学习交流,HIV抗体筛查检测流程,32,PPT学习交流,3. 病毒抗原测定 常用ELISA法检测 HIV的核心蛋白P24。此抗原特异性高，常出现于急性感染期，而在潜伏期常为阴性，但发展为AIDS时，P24抗原又可重新升高。 4. 测定病毒核酸 （1）原位杂交 （2）RT-PCR （3）病毒载量 5. C

15、D4+ T细胞计数,33,PPT学习交流,四、防治原则 1. 非医疗措施 广泛开展宣传教育，普及AIDS的传播途径和预防知识； 建立和加强对HIV感染的监测体系； 加强进出口管理，严格国境检疫； 对供血者作HIV及其抗体检测，保证血源的安全性。,34,PPT学习交流,2. 疫苗研制 新一代疫苗的必要条件 安全性； 产生CTL反应和抗体反应； 以本地流行毒株组分为主，包含尽可能多的抗原决定簇； 避免带有可能诱发增强抗体和自身免疫反应的组分。,难题是病毒包膜蛋白的高度变异性,35,PPT学习交流,3. 抗病毒药物治疗 抗HIV的药物包括三大类： 核苷类药物 非核苷类药物 蛋白酶抑制剂 联合交替使用

16、（三合一）2种HlV逆转录酶抑制剂和1种蛋白酶抑制剂即所谓“鸡尾酒疗法”，可有效抑制病毒在体内的复制，因而能减轻病人症状及延长感染者和病人的生命。,36,PPT学习交流,4. 治疗措施 抗病毒 治疗机会感染 重建免疫功能 抗肿瘤,37,PPT学习交流,举例: HIV/AIDS的实验室检查,HIV/AIDS的实验室检测主要包括： HIV抗体、HIV 核酸、CD4+ T淋巴细胞、 HIV基因型耐药检测等。 HIV1/2抗体检测是HIV感染诊断的金标准 HIV 核酸定量（病毒载量）检测和CD4+ T淋巴细胞计数是判断疾病进展、临床用药、疗效和预后的两项重要指标 HIV基因型耐药检测可为高效抗反转录病

17、毒治疗方案的选择和更换提供科学指导,38,PPT学习交流,HIV1/2抗体检测 筛查试验（含初筛和复检） 酶联免疫吸附试验（ELISA） 化学发光或免疫荧光试验 快速检测（斑点ELISA和斑点免疫胶体金或胶体硒快速试验 明胶颗粒凝集试验、免疫层析试验）,HIV1/2抗体检测 确证试验 常用的方法：免疫印迹法（WB）,39,PPT学习交流,人类免疫缺陷病毒（HIV1/2）抗体诊断试剂盒（胶体金法）说明书,本试剂是根据免疫学金标法、双抗原夹心和免疫层析原理制成。 先在硝酸纤维膜上包被基因重组HIV1/2型抗原（EnV16），再在玻璃纤维上吸附胶体金标记的HIV重组抗原（EnV18），组合制成试纸条

18、。检测时样品中如有抗HIV抗体，则与胶体金标记的基因重组（HIV）1/2型抗原蛋白（Ag-Au）形成复合物，由于层析作用复合物沿膜带移动，与检测区包被的基因重组（HIV）1/2型抗原形成双抗原夹心免疫复合物，呈现一条红色线，即可判定为HIV抗体阳性；如样品中无抗HIV抗体，则无此反应，显示阴性结果。该方法可用于检测人血清或血浆中的HIV1/2型抗体，适用于无偿献血的现场筛查。产品组成1.HIV1/2抗体诊断试纸条 50人份2.说明书 1份标本采集标本为血清样品，按临床常规方法采集。使用方法1.从袋中取出试纸条，于非样品端作好标记。2.于试纸条的样品端滴加2滴样本（约100微升）；亦可将试纸条浸

19、于样本液中，注意液面不能超过标志线，否则检测结果无效。3.反应30分钟判定结果。结果判断阳性:可见两条紫红色区带显色，既反应线（T）和质控线（C）。阴性:仅见一条紫红色区带，即质控线（C）显色。无效:无任何色线出现或仅反应带显色，应换新试纸条重测。,40,PPT学习交流,筛查试验 阴性：可出具HIV1/2抗体阴性报告 见于未被HIV感染的个体 但处于窗口期的新近感染者也可呈阴性反应,41,PPT学习交流,筛查试验,阳性： 应用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂进行重复检测 或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行重复检测 如两种试剂复测均呈阴性反应，则为HIV抗体阴性 如有一种或两种试剂

20、呈阳性反应，需进行HIV抗体确证试验,42,PPT学习交流,确诊试验,出现HIV1/2抗体特异带，但不足以判定阳性，报告HIV1/2抗体不确定,可在4周后随访：如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性 如随访期间发生带型进展，符合HIV抗体阳性判定标准则为HIV抗体阳性 如带型仍不满足阳性标准，继续随访到8周，如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性,43,PPT学习交流,确诊试验： 满足HIV阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性标准可视情决定是否继续随访 经确证试验HIV-1/2抗体阳性者，出具HIV-1/2抗体阳性确认报告，并按规定做好咨询、保密和报告工作。,44,PPT学习交流,实验室检查：病毒

21、载量测定,病毒载量一般用血浆中每毫升HIV RNA的拷贝数（copies/ml）或每毫升国际单位（IU/ml）来表示。,45,PPT学习交流,实验室检查：病毒载量测定,病毒载量测定常用方法 反转录PCR系统（RT-PCR） 核酸序列依赖性扩增（NASBA NucliSens）技术 分枝DNA信号放大系统（bDNA） 实时荧光定量PCR扩增技术（real-time PCR）,46,PPT学习交流,实验室检查：病毒载量测定,病毒载量测定的临床意义 预测疾病进程 提供开始抗病毒治疗依据 作为HIV感染早期诊断的参考指标 小于18月龄的婴幼儿HIV感染诊断可以采用核酸检测方法，以2次核酸检测阳性结果作

22、为诊断的参考依据 18月龄以后再经抗体检测确认,47,PPT学习交流,实验室检查：病毒载量测定,推荐病毒载量检测频率 对于已接受抗病毒治疗6个月以上、病毒持续抑制的患者，可每6个月检测一次。 HAART 治疗6个月内或病毒载量抑制不理想或需调整治疗方案时病毒载量的检测频率需根据患者的具体情况由临床医生决定。 如条件允许，建议未治疗的无症状HIV感染者每年检测一次，ART初始治疗或调整治疗方案前、初治或调整治疗方案初期每4-8周检测一次，以便尽早发现病毒学失败。病毒载量低于检测下限后，每3-4个月检测一次， 对于依从性好、病毒持续抑制达2-3年以上、临床和免疫学状态平稳的患者可每6个月检测一次。

23、,48,PPT学习交流,CD4+T淋巴细胞检测,CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞，HIV感染人体后，出现： CD4+ T淋巴细胞进行性减少 CD4+/CD8+ T细胞比值倒置现象 细胞免疫功能受损 进行HAART治疗，CD4+T淋巴细胞在病程的不同阶段可有不同程度的增加,49,PPT学习交流,目前常用的CD4+T淋巴细胞亚群检测方法为流式细胞术 可以直接获得CD4+T淋巴细胞数绝对值 或通过白细胞分类计数后换算为CD4+T淋巴细胞绝对数 如果进行HAART治疗，CD4+T淋巴细胞在病程的不同阶段可有不同程度的增加,50,PPT学习交流,CD4+T淋巴细胞计数的临床意义是 了解机体的

24、免疫状态和病程进展 确定疾病分期和治疗时机 判断治疗效果 HIV感染者的临床合并症,51,PPT学习交流,CD4+ T淋巴细胞计数的检测间隔时间需根据患者的具体情况由临床医生决定 一般建议对于CD4+ T淋巴细胞数 350/mm3的HIV无症状感染者，每6个月应检测一次 对于已接受ART的患者在治疗的第一年内应每三个月进行一次CD4+ T淋巴细胞数检测，治疗一年以上且病情稳定的患者可改为每半年检测一次。,52,PPT学习交流,HIV 基因型耐药检测,HIV耐药检测结果可为艾滋病治疗方案的制定和调整提供重要参考，耐药测定方法有基因型和表型，目前国外及国内多用基因型 推荐在以下情况进行HIV基因型

25、耐药检测 抗病毒治疗病毒载量下降不理想或抗病毒治疗失败需要改变治疗方案时 如条件允许，进行抗病毒治疗前，最好进行耐药性检测，以选择合适的抗病毒药物，取得最佳抗病毒效果 对于抗病毒治疗失败者，耐药检测需在病毒载量1000拷贝/ml且未停用抗病毒药物时进行，如已停药需在停药4周内进行基因型耐药检测,53,PPT学习交流,HIV 基因型耐药检测,HIV基因型检测出现HIV耐药 表示该感染者体内病毒可能耐药，同时需要密切结合临床，充分考虑HIV感染者的依从性，对药物的耐受性及药物的代谢吸收等因素综合进行评判 改变抗病毒治疗方案需要在有经验的医师指导下才能进行 HIV耐药结果阴性 抗表示该份样品通过基因

26、型耐药检测未检出耐药性，不能确定该感染者不存在耐药情况,54,PPT学习交流,我国抗病毒治疗面临的挑战,整体治疗水平低,监测能力受限制 药物种类少,长期治疗的毒副作用越来越突出 特殊人群的治疗(HCV/HBV,TB,孕妇,儿童) 病毒耐药带来更大的治疗困难,55,PPT学习交流,核苷类药物被细胞编码的磷酸激酶作用后，掺入子代病毒DNA中造成病毒基因组缺陷，不能正常进行复制和转录。 叠氮胸苷 Zidovudine (AZT) 齐多呋定 用于治疗艾滋病获得性免疫缺陷综合征（）。病人有合并症（卡氏肺囊虫病或其他感染）时尚需应用对症的其他药物联合治疗。 成人常用量：次，每小时次，按时间给药。有贫血的病

27、人：可按次给药。,56,PPT学习交流,国际上现有的抗反转录病毒药物,核苷类似物 AZT, zidovudine, Retrovir 叠氮胸苷 ddI, didanosine, VidexEC 地达诺新 ddC, zalcitabine, Hivid扎西他宾 d4T, stavudine, Zerit司他夫定 3TC, lamivudine, Epivir拉米夫定 abacavir, Ziagen阿巴卡韦 FTC, emtricitabine, Emtriva恩曲他滨 8.tenofovir, Viread泰诺福韦,57,PPT学习交流,非核苷类反转录酶抑制剂,9.delavirdine, Rescriptor 地拉韦啶 10.nevirapine, Viramune 奈韦拉平 11.efavirenz, Sustiva 依法韦仑 12.etravirine, Intelence依曲伟林,58,PPT学习交流,13. indinavir, Crixivan +/-r 茚地那韦 14. saquinavir Invirase +r 沙奎那韦 15. ritona