菌落总数与大肠菌群数测定.ppt

1、菌落总数与大肠菌群数测定,哈尔滨医科大学公共卫生学院 卫生微生物学教研室,主要内容,水样的采集与送检 菌落总数测定 大肠菌群测定 MPN法原理（拓展内容）,水样的采集和送检,采样瓶：洗净、包扎、灭菌 自来水：烧灼龙头，放水5-10min 中和余氯：每500ml水样，预加1.5% Na2S2O3 2ml 水源水：距水面10-15cm 送检时间：=2h(常温) ，=4h(冷藏),采样瓶,烧灼水龙头,菌落总数测定,实验目的 掌握菌落总数测定方法 实验原理 不同稀释度的水样，营养琼脂培养基，37 ，24h，菌落数,菌落总数测定,器材与试剂： 水样，无菌蒸馏水，营养琼脂培养基，1ml吸管，10ml吸管，

2、平皿,菌落总数测定,实验步骤 1.稀释水样： 10ml水样加入90ml无菌蒸馏水、 振荡、彻底混匀 2.做1：10系列稀释 三支9ml无菌蒸馏水试管 3.倾注培养 1ml稀释水样、15ml培养基（45 ） 4.倒置培养：37 ，24h,倾注培养,培养结果,菌落总数测定,实验步骤 5.菌落计数： 肉眼观察，可用放大镜，可标记 必要时分区计数，菌落成片者作废 计算方法 某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值 选择菌落数在30-300之间的稀释度 （1）仅有一个稀释度在此范围： 菌落数稀释倍数,菌落总数测定,计算方法： （2）有两个稀释度在30-300之间 菌落数之比2，选较小值 菌落数之比300

3、取稀释倍数最大者 （4）所有稀释度均30 取稀释倍数最小者 （5）没有任何稀释度在30-300之间 选最接近该范围者 结果单位：CFU/ml,菌落总数测定,注意事项： 1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识,大肠菌群数测定,实验目的 实验原理 37 ，24h，乳糖，产酸（溴甲酚紫），产气（小倒管） 三步法：初发酵、分离培养、复发酵 器材与试剂 水样、无菌蒸馏水、乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝培养基，革兰染液 1ml吸管、10ml吸管、试管、平皿、载玻片,初发酵,器材与试剂 水样、90ml无菌水、9ml无菌水、5ml三倍乳糖蛋白胨，10ml吸管、1m

4、l吸管、酒精灯、吸球,大肠菌群数测定,实验步骤： 1.初发酵 （1）10ml水样+3倍乳糖蛋白胨培养液（5ml） （2）三个稀释度（原水样，1:10和1：100）， 各取1ml+乳糖蛋白胨培养液（10ml） （3）培养：37 ，24h （4）观察指标： 产酸（黄色），产气（倒管内有气泡）,吸取水样,加注水样,初发酵结果,左2为阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生。,大肠菌群数测定,实验步骤 2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （4）培养： 37，24h,分离培养,器材与试剂 初发酵结果（4

5、只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基,分区划线法,分区划线法,操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动,大肠菌群数测定,实验步骤 2.分离培养： （5）菌落特征： 深紫黑色、有金属光泽 紫黑色、无或略有金属光泽 淡紫红色、中心颜色深 （6）革兰染色、镜检：选特征菌落,革兰染色法,器材与试剂 结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸,革兰染色法,涂片：接种环，挑取菌落， 生理盐水一滴，涂匀 热固定：通过火焰若干次 初染：结晶紫一滴

6、，1min，水洗 媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗 脱色：95%乙醇，30s或至无色为止 复染：复红一滴，30s,涂片,热固定,初染,媒染,脱色,复染,革兰氏染色阴性,革兰氏染色阳性,革兰染色法,复发酵,器材与试剂 培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管,大肠菌群数测定,实验步骤 3.复发酵 （1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落1-3个 （2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液 （3）培养：37，24h （4）观察指标：产酸，产气,液体接种,复发酵,复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生,大肠菌群数测定,注意事项： 1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.

7、显微镜保养 5.液体接种,MPN法原理,MPN法（Most Probable Number Method） 目的：对某种细菌进行选择性计数 核心思想：泊松分布 实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值,MPN法原理,MPN法（Most Probable Number Method） 1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布: P(x=k)=e-x xk/k! x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数 2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为： 其中C为常系数 V为总水样量，x为细菌个数,MPN法原理,3.当y(x)max，XMPN 4.由于y(x)为单极值函数，令dy/dx=0,即 5.解此方程，得x=MPN 6.该方程为超越方程，一般采用数值法求近似解 7.日常实验时采用查表法推算MPN值。 8.表格在教材第260-261页。,饮用水卫生标准,菌落总数：不超过100 CFU/ml 大肠菌群：不得检出,引自GB/T5750-2006,参考资料,张朝武.卫生微生物学M.第四版.北京.人民卫生出版社.2007:255-266 GB/T5750-2006.生活饮用水卫生