基因工程 (1).ppt

1、在此输入小组成员文字标题,蜘蛛羊,1,小组成员：曹毅 刘红叶 郭 剑 蒙葳 韦尚谋 彭凤姣,目 录,蛛丝蛋白定义 蛛丝的用途 基因工程获取蛛丝 局限性,蛛丝蛋白定义,蛛丝蛋白是一种很特殊的纤维蛋白。是由丙氨酸组成的B一折叠和富含脯氨酸的a一螺旋，及其紧密堆砌的二级结构使之成为一种半结晶状态的分子弹簧结构，决定了蛛丝具有强度高，韧性大等一些重要特点。,蛛丝用途,（1）军事方面，作防弹背心、防弹衣等。 （2）航空航天方面，可制作结构材料、复合 材料及宇航服等。 （3）建筑方面，可用于桥梁、高层建筑及民 用建筑等方面。 （4）农业和食品方面，制作捕捞网具，包装 材料等。 （5）医疗和保健方面，可作高

2、性能的生物材 料，如人工筋腱、人工韧带及人工器官、手术缝 合线等。,基因工程获取蛛丝,拟蛛丝蛋白基因单体的多聚化,拟蛛丝蛋白基因的构建,拟蛛丝蛋白基因单体的获得,乳腺高效表达拟蛛丝蛋白基因的构建,3.1拟蛛丝蛋白基因信号肽与终止密码子 DNA片段的克隆,3.3 8聚体和 16聚体克隆到 pGEM5-3S,3、拟蛛丝蛋白基因的构建,3.2在含信号肽片段的载体上添加酶切位点,3.4得到pGEM5- 3S8和 pGEM5-3S1基因,设计并合成6 条80 bp 左右的寡核苷酸链，其中每2 条单链有18 个碱基的互补末端，这样2 条寡核苷酸单链在Taq酶作用下，可通过其互补的粘性末端在PCR上进行补平

3、延伸，形成3 条双链DNA，再将 S12、S34 和 S56 这3 条双链 DNA 以 31 3 （否则将得不到大量的扩增产物）的比例混合，再次通过其互补末端延伸补平。通过PCR扩增来增加其产量可得到大量的拟蛛丝蛋白基因单体 。,1、拟蛛丝蛋白基因单体的获得,在得到拟蛛丝蛋白基因单体片段后，必须将拟蛛丝蛋白基因单体进行多聚化，这样拟蛛丝蛋白才有一定刚性和弹性。得到拟蛛丝蛋白基因单体2 聚体、4 聚体、6 聚体、8 聚体和16聚体，它们分别标记pDOU、pBS4、pBS6、pBS8 和pBS16,2、拟蛛丝蛋白基因单体的多聚化,拟蛛丝蛋白基因要在动物乳腺中表达，必须在多聚化的基因上加上必要的信号

4、肽和终止密码子，这样拟蛛丝蛋白基因才能成为乳腺表达的基因。用BamHI和NsiI双酶切8 聚体pBS8、16 聚体pBS16 及pGEM5-3S（T 载 体（pGEM-5S）及 pGEM-3zf 质粒酶切后连接起来），回收pBS8 和pBS16 的外源片段部分及pGEM5-3S载体部分，然后将pBS8 和pBS16 外源片段分别与pGEM5-3S 载体部分相连，转化，酶切鉴定阳性克隆。将核苷酸片段的 8 聚体和 16聚体基因分别标记为 pGEM5- 3S8和 pGEM5- 3S16。,3、拟蛛丝蛋白基因的构建,pGEM5- 3S8和pGEM5-3S16 均含有可在乳腺细胞表达的拟蛛丝蛋白基因，

5、但要高效表达，必须将该基因构建到乳腺高效表达载体上。我们用的乳腺高效表达载体是pBC1。乳腺高效表达载体pBC1 只有一个Xho I位点供外源片段的插入。因此，在含信号肽及终止密码子的核酸序列的5 和3 末端均加上了Sal I酶切位点，Sal I和Xho I是一对同尾酶（切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶）。pBC1 载体较大，为提高转化效率，采用电击转化，用 PCR 扩增法鉴定克隆，引物为 F3 和F4， F3 在 pBC1 载体上，而F4 则位于信号肽片段与载体连接区，扩出 370 bp 的拟蛛丝蛋白基因片段连到 pBC1 载体上的阳性克隆。最后将它们分别被标记为pBC1-8 和 pBC1-16。乳腺高效表达拟蛛丝蛋白基因构建完成。,4、乳腺高效表达拟蛛丝蛋白基因的构建,通过“显微注射法”或“细胞转染法”将该载体整合到羊细胞基因组中从而获得转基因胚胎或细胞，并移植于母羊子宫，发育成熟后出生转基因羊。,蜘蛛羊的产生,基因表达载体的构建,目的基因的获取,将载体导入受体细胞,具备蜘蛛DNA的转基因羊所产的羊奶非常独特，可以进行提纯、风干，可纺成像蜘蛛丝一样的丝状结构。,转基因山羊所产的每夸脱羊奶可制成0.5盎司丝，这相当于上百只蜘蛛产出