华东理工微生物课件7.ppt

1、微生物的生长及其控制 生长(growth)：个体体积或重量的变化 繁殖(reproduction)：个体数量的变化 生长和繁殖是交替进行的 个体生长个体繁殖群体生长 群体生长个体生长 个体繁殖 衡量群体生长的量： 重量、体积、密度、浓度、个体数目等,微生物生长的测定 测定生长量 测体积 称干（湿）重 比浊法 生理指标法：测含氮量 测含碳量 测磷、DNA、RNA、ATP 呼吸强度 生物热 耗氧量,比浊法,turbidity,微生物快速测定（ATP）,2/webui/,微生物快速检测设备-奥地利 sy-Lab，Bactrac,颜色变化,FOSS公司BactoS

2、can FC牛奶中总菌数快速检测仪,采用流式细胞原理。对微生物进行核酸染色，用流式细胞技术进行计数,流式细胞技术及激光扫描技术,测细胞的个数 血球计数法 平板活菌计数法 菌落形成单位 (cfu, colony forming unit） 膜过滤法,血球计数法,平板活菌计数法,TTC (2，3，5-氯化三苯基四氮唑)纸片法,膜过滤法用于较稀溶液的计数方法,微生物的生长规律 细菌的个体生长和同步生长 研究细菌个体的生长方法 用电子显微镜观察细胞的超薄切片 同步培养(synchronous culture) ： 使群体中的所有个体细胞尽可能的处于同样细胞生长和分裂期 中,机械方法,离心方法 过滤分离

3、法 硝酸纤维素滤膜法,环境条件控制技术,温度 培养基成份控制 其他（如光照和黑暗交替培养）,同步生长（synchronous growth） 通过同步培养使细胞群体处于分裂步调一致的状态 获得同步生长的方法,硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法,由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代， 随后又逐渐转变为随机生长。,典型生长曲线(growth curve) 四个阶段： 延滞期(lag phase) 指数期(exponential phase) 稳定期(stationary phase) 衰亡期(decline phase ,death phase),生长速率常数(growt

4、h rate constant): 每小时分裂的代数 R 代时 ：G G1/R,迟缓期的特点：,分裂迟缓、代谢活跃,细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均 长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大； 细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、 酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。 对外界不良条件反应敏感。,以上特征说明细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。 在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。,迟缓期出现的原因：,微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏足够的能量和必需的生长因子。调整代谢需要一段适应期,调整代谢,迟缓期的长短与菌种的

5、遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境 条件等因素有关,常用缩短迟缓期的手段,(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；,(2)利用对数生长期的细胞作为种子；,(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；,(4)适当扩大接种量,指数期(exponential phase) 特点 生长速率常数最大 代时(generation time)最短 细胞平衡生长 酶系活跃 代谢旺盛 作为发酵生产的良好种子 ，可缩短延滞期,影响微生物增代时间（代时）的因素：,1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；,2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短,3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率

6、与营养物浓度呈正比，,4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。,稳定期(stationary phase) 特点 生长速率常数为零 菌体产量达最高点 菌体产量与营养物消耗有 一定的比例关系,稳定期到来的原因 营养物耗尽 积累了有害代谢产物 理化条件不适宜,细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物，芽孢杆菌开始形成芽孢，积累次级代谢产物,如何延长稳定期 增加养料 补料 调节PH,衰亡期(decline phase； death phase) 特点： 负生长 菌体自溶(autolysis),微生物的连续培养 单（分）批培养(batch culture) 密闭培养(closed cultu

7、re) 连续培养(continuous culture) 开放培养(open culture),恒浊器（turbidostat） 改变培养基的流速，以控制菌的浓度恒定。 微生物在恒浊器中始终以最高的生长速率进行生长。 用于获得大量菌体、与菌体生长相平行的代谢产物的生产,恒化器（chemostat；bactogen） 使培养液流速保持不变，以某一营养物为生长限制因子,并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。,Nutrient concentration and growth,凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。 限制性因子必须是机体生长所必需的营养物

8、质，如氨基酸和氨等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，因而可在一定浓度范围内能决定该机体生长速率。 恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其他营养物均过量 细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度，并低于最高生长速率,单级连续培养器(one-step continuous fermentor)：代谢产物的生产速率与菌体生长速率平行 多级连续培养器(multi-step continuous fermentor)：代谢产物的生产速率与菌体生长速率不平行,连续发酵（continuous fermentation） 连续培养用于生产实践时，就称为连续发酵

9、连续培养的优缺点 优点： 高效 便于自动控制 产品质量稳定 缺点：菌种易退化 易污染杂菌 培养基利用率低,影响微生物生长的主要因素 温度 从两个方面来看： 温度上升，反应速率加快，生长速率加快 温度上升，蛋白质、核酸被破坏,微生物的生长有一个温度范围，在这个范围内有一个生长的最适温度、最低温度和最高温度 最适温度：菌代时最短，生长速率最高,Temperature Range for growth,温度影响酶活性，细胞膜的流动性，物质的溶解度,氧气 专性好氧菌(strict aerobe) 兼性厌氧菌(facultative aerobe) 微好氧菌(microaerophilic bacter

10、ia) 耐氧菌(aerotolerant anaerobe) 厌氧菌(anacerobe),Oxygen for growth,好氧生物因为有SOD，因此剧毒的超氧阴离子自由基（O2）被歧化成毒性稍低的H2O2，在过氧化氢酶的作用下，H2O2再变成无毒的H2O,An anaerobic work chamber and incubator,PH 最适PH 最低PH 最高PH PH的影响 影响营养物的离子化程度 影响环境中有毒物质对微生物的毒性 影响代谢反应中各种酶的活性,有害微生物的控制 物理杀菌因素的代表温度 利用高温杀菌 焚烧灭菌 干热灭菌 灼烧灭菌,煮沸消毒法 湿热灭菌 高压蒸汽灭菌法

11、间歇灭菌法 巴斯德消毒法,The autoclave,化学杀菌剂或抑菌剂 表面消毒剂 重金属盐类：红汞 有机化合物(酚类、醇类、酸类、醛类) 氧化剂：卤素及其化合物，过氧化物 表面活性剂：新洁尔灭 肥皂 染料：龙胆紫 气体：环氧乙烷,抗代谢药物的代表磺胺类药物 抗代谢药物： 一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似，并可干扰其正常代谢活动的化学物质 SMZ：磺胺二甲恶唑 sulfamethoxazole,对氨基苯甲酸(PABA)结构： 磺胺结构： 叶酸结构：,酶1 酶2 二氢喋啶二氢喋酸二氢叶酸 PABA（磺胺） Glu 酶3 前体 四氢叶酸 TMP 嘌呤 嘧啶 核苷酸,酶1：二氢蝶酸合成

12、酶 酶2：二氢叶酸合成酶 酶3：二氢叶酸还原酶,三甲氧苄二氨嘧啶,抗生素 抑制细胞壁的形成：青霉素 青霉素不能口服，它不耐酸，在胃中被降解 影响细胞膜的功能：多粘菌素 干扰蛋白质合成： 链霉素 阻碍核酸的合成： 博莱霉素,-内酰氨类抗生素,药物对核糖体的不同作用部位,微生物对环境的适应性 产生钝化酶 细胞内被药物作用的部位发生改变 改变细胞膜的透性,微生物的抗药性,青霉噻唑酸,细菌的耐药机制 1.产生钝化酶,青霉素类：青霉素酶，头孢菌素酶,青霉素抑制细胞壁的合成，主要是抑制转肽酶，因为青霉素的-内酰胺环结构和D丙氨酸的结构相似，可与转肽酶的活性中心结合，生成青霉素噻唑酰基酶（oenicillo

13、yl enzyme），从而使转肽酶失去转肽活性 -内酰胺酶使-内酰胺环结构开环（水解-内酰胺环的酰胺键），而使青霉素失去与转肽酶结合的能力，细菌表现出抗药性,寻找解决此类抗药性的思路 对底物（青霉素）进行修饰 破坏钝化酶,替卡西林（羧基噻吩青霉素）,哌拉西林（氧哌嗪青霉素）,替卡,阿莫西林（羟氨苄青霉素）,-内酰胺酶抑制剂的发展 橄榄酸（橄榄色链霉菌）： -内酰胺族化合物 穿透细胞壁和细胞膜的能力差 在体内代谢快 克拉维酸（棒酸）（棒状链霉菌）：杂氧青霉烯,-内酰胺酶抑制剂的作用原理 克拉维酸对-内酰胺酶的活性位点有高的亲和力，可与催化中心结合，以竞争性抑制方式发挥作用 与酶分子中的丝氨酸的羟

14、基发生反应，通过-内酰胺羰基和-内酰胺环打开而使酶酰化,脱酰化,氨基糖苷类钝化酶 对氨基糖苷类抗生素分子中的某些保持抗菌活性所必须的基团进行修饰，使其与作用靶位核糖体的亲和力下降 氨基糖苷酰基转移酶（aminoglycoside acetyltransferasea AAC） 氨基糖苷腺苷转移酶（aminoglycoside adenylytransferasea AAD） 氨基糖苷核苷转移酶（aminoglycoside-necleotide transferasea ANT） 氨基糖苷磷酸转移酶（aminoglycoside phosphotransferasea APH）,酰基转移酶AA

15、C 腺苷转移酶AAD 核苷转移酶ANT 磷酸转移酶APH,对氨基糖苷类钝化酶抑制剂的研究还未取得突破性进展 去除易被钝化酶修饰的基团 卡那霉素地贝卡星(双去氧卡那霉素) 对抗生素的分子进行结构改造，以保护 活性基团 卡那霉素丁胺卡那霉素（R3氨基羟丁酰）,大环内酯类抗生素钝化酶 红霉素酯酶：酯解十四元大环内酯类抗生素的大环内酯部分,林可霉素类钝化酶 使抗生素分子的3、4位羟基磷酸化或核苷酰化,2.细菌细胞膜渗透性改变产生耐药性 细胞外膜渗透性降低 铜绿假单孢菌/分枝杆菌没有高渗透性孔蛋白，固有性耐药 如-内酰胺类抗生素 主动药物转运 转运器具备在细胞质中捕获药物分子的能力，即当药物分子插入细胞膜双层后，直接将其捕获 细菌菌膜的形成（是一种群体保护机制） 能够形成菌膜的细菌往往对抗菌药物具有较高的耐药性,六氯酚,季铵化合物,苯基苯酚,氯,主动药物转运,设计药物思路：1.了解外排转运器是如何与底物结合的 2. 加快药物进入细胞的速度,细菌菌膜形成,3. 药物作用靶位被修饰或发生突变 靶位与抗生素结合并使抗生素发挥作用的核糖体、被抗生素直接抑制的某些酶（靶酶）或有关蛋白（靶蛋白） 氨基糖苷类抗生素 编码S16核蛋白的基因发生突变，使该蛋白的