实验三 质粒DNA的提取与酶切.ppt

1、紫外分光光度法检测DNA，实验三，重组质粒DNA的提取，酶切鉴定和电泳检测，实验安排，上午：质粒DNA提取限制酶切鉴定琼脂糖凝胶制备下午：酶切产物的电泳紫外分光光度法修订DNA检测实验课题的要求和安排，1提取质粒DNA 2限制酶与医学有什么关系？ 3检测生物样品中核酸或蛋白质含量的技术或方法有哪些问题，1设备操作注意点，752型分光光度校正的使用预热调零对照重复2 )颜色杯的使用，注意点，容量清洁安全，2试剂使用注意点，限制酶的使用：低稳定操作。 取量准确的37 C孵化，3实验课题设置的要求和安排，2-3人一组，各组ppt报告8-10分钟，老师提问3-5分钟，第一部分：重组质粒DNA提取，1实

2、验步骤：在EP管中加入1.5ml培养物。 立即轻轻摇动，加入数次150l的冰溶液III，摇动10s，冰浴35min，12000rpm10min，细菌分解，释放质粒DNA，将上清转移到新的EP管中，加入1/2体积酚1/用加入了2体积氯仿的离心12000rpm5min将上清液转移到新的EP管中，加入等体积氯仿：异戊醇(订约450l )振荡混炼，离心12000rpm5min，除去杂质，纯化质粒DNA， 将上清转移到新的EP管中加入2倍体积95%的乙醇的100 l 75%乙醇洗净沉淀、12000rpm2min舍弃上清，静置干燥、0.1TE 20 l溶解DNA酶切断鉴定(16 l )、质粒(plasmi

3、d )、质粒是从细菌体内存在的染色体中独立自主复制的有些质粒可以携带外来DNA，作为目的基因进入受体细胞的载体。 质粒是细菌内的共生型基因，具有相对独立性。 在细菌中垂直遗传可以给宿主细胞表型。 双链封闭环状DNA中分子量的大小不同。 2实验原理分离纯化质粒DNA的三个主要步骤：培养细菌收集和分解质粒扩增细菌纯化质粒DNA的方法均利用质粒DNA分子相对较小、共价键环状封闭的性质。 碱法提取质粒的主要试剂作用原理，溶液由葡萄糖、EDTA、TrisCl组成。 葡萄糖的作用使溶液粘度增加，减少萃取过程中的机械剪切作用，防止质粒破坏。 EDTA的作用是使镁等二价金属离子发生络合，防止DNA酶对质粒分子

4、的分解。 TrisCl能使溶菌液维持溶菌作用的最佳PH范围。 溶液： SDS、NaOH、SDS的作用：分解核蛋白，与蛋白质结合变性的NaOH的作用：破碎细胞，使DNA分子变性。 溶液： KAc、HAc、h中和溶液的OH- K置换SDS中的Na生成PDS (白色沉淀)，与蛋白质和染色体DNA共沉淀，用RNA酶消化去除RNA，用酚提取法去除残留蛋白质。 质粒DNA的进一步纯化：小分子质粒DNA呈天然结构型，溶于buffer。 可通过离心分离一起去除沉淀(染色体DNA、蛋白质PDS复合体等)。 溶液，处理后：质粒的三种配置：当封闭的环状DNA开环DNA在两链中的一个或多个位置断裂时，分子通过旋转去除

5、链的张力。 线状DNA如果双方的链断开的话就是线状DNA。 注意点：提取的DNA不纯，含有其他杂质(蛋白、多糖)的改性不充分。 重要过程的反应时间过短离心时间或速度不足。 提取的DNA呈涂布状：操作过程中用力过大，动作粗暴的操作系统有污染。 染色体DNA混杂：变性过程不完整，试剂配置存在问题。第二部分：酶切鉴定(双酶切)、重组质粒、BamH I、Hind III、反应体系(20l )、母液，进一步分4l/人，分为3大组瞬时离心37C，1-3小时电泳检查，2 .目的基因与质粒载体的连接，3 4 .选择，5 .目的基因表达，1 .目的基因的获得，DNA片段(目的基因)和载体DNA分子合成产物(蛋白

6、质)，重组DNA技术的一般过程，基因克隆形象，宿主基因组，基因工程学诞生的技术突破，限制酶(restriction enzymm Werner Arber理论预见到限制酶，Daniel Nathans用限制酶切取SV40 DNA片段，Hamilton O. Smith获得第一个限制酶，1978年获得Nobel生理或医学奖， 限制性核酸内切酶可识别双链DNA分子中的某些特定酶从中切断DNA双链的内核酸酶源：原核生物功能：自保护细菌的限制和修饰系统(R/M系统)、pUC119物理图像、重组质粒、BamH I、Hind III、双酶切断、 电泳检查M:Marker 1:酶切样品1 2 :酶切样品2

7、3 :酶切样品3 4 :未酶切质粒，一般重组质粒酶切结果电泳图，第三部分紫外分光光度修正检测DNA，特征灵敏度高：测定下限达105106 mol/L， 精度能够满足微量成分的测定，光谱区域、10nm200nm、200nm 380nm、380nm 780nm、780 nm 2.5 m、2.5 m 50 m、50 m 300 m、氢灯、复合光(阳光及钨灯)。 光学原理是在吸收光谱或光源与棱镜之间加入某种物质的溶液，光源的发光光谱中的某种波长的光被溶液吸收而消失，被该溶液吸收的光谱称为该溶液的吸收光谱。苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱、Lambert-Beer定律、浓度dsDNA (单位为g /ml)=

8、50(OD260 )稀释倍数、用TE适当稀释被测定DNA溶液，记录稀释倍数。 TE为空白、“调整0”、“调整100”。 注意：首先选择波长260nm或280nm。 用分光光度修正法定量DNA实验操作测定了260nm的吸收值。 260nm读取值用于计算试样中核酸的浓度4，测定了280nm的吸收值。 核酸的纯度可以从260nm和280nm下的读取值之比(OD260/OD280 )推定。 一般DNA的纯品，其比为1.8。 低于该值可能有蛋白质和其他杂质的污染；高于该值的值表明有RNA污染。 第四部分分子医学实验设施修订，一、分子医学实验设施修订理解学到的实验方法和技术可以用基本的实验方法和技术进行简

9、单的科学研究，二、实验设施修订的基本内容实验目的和意义(为什么？ 实验材料、试剂、机器(用什么制作？ 实验方法和程序(怎么办？ 实验指标(看什么？ 实验期望结果和分析(如何评价)，如肝癌患者和正常人血清蛋白质分布的初步比较1 .研究目的和意义通过比较肝癌患者和正常人血清中蛋白质的种类和数量的差异，了解肝癌患者血清中出现的异常蛋白质和正常蛋白质的变化，初步探讨该变化对判断肝癌的诊断和病情的作用。2材料、试剂和仪器标本：正常人血清，不同病程肝癌患者血清(早、中、晚期)，蛋白质标准对照试剂：用于不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的试剂仪器和设备：电泳仪、电泳槽、染色缸、漂洗缸、烧杯， 吸管3 .实验方法和工艺方法：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳工艺：试剂准备凝胶样品处理电泳染色和脱色，4 .实验观察指标聚丙烯酰胺凝胶上电泳区带分布电泳区带颜色深，5 %，同时肝癌患者白蛋白颜色浅，定量显示正常人中所述情节