生物制药1.ppt

1、第七章 生物技术、生物工程与生物制药,第一节 生物学简介,第二节 现代生物工程,第三节 生物药物,2,现代生物工程简介,一、基 因 工 程,二、酶 工 程,三、细 胞 工 程,四、发 酵 工 程,3,1. 基因工程的诞生,20世纪70年代中期，两项关键技术的问世，使得基因工程成功诞生： DNA分子的体外切割与连接技术 DNA分子的核酸序列分析技术,4,2. 基因工程的定义和研究内容,定义： 基因工程（Gene engineering）是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他 载体分子，构成遗传物质的新组 合，并使之掺入到原先没有这类 分子的寄主细胞内，而能稳定地 繁殖，并通过工程化为人类提供

2、有用的产品和服务的技术。,5,2. 基因工程的定义和研究内容,除了少数RNA病毒外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术(DNA Recombination)。,DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为基因克隆(Gene cloning)或分子克隆(Molecular cloning)。,6,2. 基因工程的定义和研究内容,步骤： 切 从供体细胞中分离出 基因组DNA，用限制 性核酸内切酶分别将 外源DNA（包括外源 基因或目的基因）和 载体分子切开。,7,2. 基因工程的定义和研究内容,步骤

3、： 接 用DNA连接酶将含 有外源基因的DNA 片断接到载体上， 形成DNA重组分子。,8,2. 基因工程的定义和研究内容,步骤： 转 借助于细胞转化手 段将DNA重组分子 导入受体细胞中。,9,2. 基因工程的定义和研究内容,步骤： 增 短时间培养转化 后细胞，以扩增 DNA重组分子或 使其整合到受体 细胞的基因组中。,10,2. 基因工程的定义和研究内容,步骤： 检 筛选和鉴定转化 细胞，获得使外 源基因高效表达 的基因工程菌或 细胞。,11,3. 基因操作的工具和技术,工具酶 核酸内切限制酶,1978 Nobel Prize,12,3. 基因操作的工具和技术,工具酶 核酸内切限制酶 “分

4、子剪刀”,13,3. 基因操作的工具和技术,工具酶 核酸内切限制酶 “分子剪刀”,14,3. 基因操作的工具和技术,工具酶 DNA连接酶 T4 ligase：1967,15,3. 基因操作的工具和技术,基因克隆载体 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体,16,3. 基因操作的工具和技术,DNA的提取 物理分离法 平衡等密度离心法 凝胶电泳分离 DNA印迹（Southern blotting）,17,3. 基因操作的工具和技术,DNA的提取 基因组文库和cDNA 文库分离目的基因,18,3. 基因操作的工具和技术,DNA的提取 PCR 变性(9095) 复性(3760) 延伸(7075),19,3

5、. 基因操作的工具和技术,目的基因和载体的连接 DNA连接酶,20,3. 基因操作的工具和技术,重组DNA向宿主细胞的转移、鉴别和表达 目的基因导入受体细胞 合适的受体细胞 合适的克隆载体 合适的基因转移方法 转化、转导、杂交 细胞融合、显微注射,21,human,Arabidopsis 拟南芥,Thermotoga maritima,Escherichia coli,Buchnerasp. APS,Rickettsia prowazekii,Ureaplasma urealyticum,Bacillus subtilis,Drosophila melanogaster,Thermoplasm

6、a acidophilum,Plasmodium falciparum,Helicobacter pylori,mouse,Caenorhabitis elegans,rat,Borrelia burgorferi,Borrelia burgorferi,Aquifex aeolicus,Neisseria meningitidis Z2491,Mycobacterium tuberculosis,22,3. 基因操作的工具和技术,阳性克隆的筛选和鉴定 遗传检测法 双酶切片断重组法 报告基因法,23,3. 基因操作的工具和技术,克隆的进一步鉴定 限制性内切酶分析法 分子杂交法 PCR法 DNA

7、测序法 目的基因转录产物检测Northern blotting 目的基因翻译产物检测Western blotting,24,3. 基因操作的工具和技术,目的基因在受体 细胞中的表达,25,4. 基因工程药物,多肽 蛋白质 酶 激素 疫苗 单克隆抗体 细胞因子,定义：又称生物技术药物，是利用重组DNA技术生产的,rh IFN、rh IL、rh CSF、bFGF、EGF,Insulin、GH、EPO、胰高血糖素、降钙素,rSK、 rSAK、 rUK、SOD,血清白蛋白,水蛭素,流感、疟疾、艾滋病、狂犬病、结核病,狂犬病毒、抗肝癌、胃癌、白血病,26,4. 基因工程药物,基因工程药物的优势 产率,2

8、7,4. 基因工程药物,基因工程药物的优势 经济效益,生物技术产品的销售额,28,4. 基因工程药物,胰岛素,1977年，首次将人胰岛素基因通过大肠杆菌表达成为人胰岛素，基因工程学诞生。,29,4. 基因工程药物,人体生长激素,30,31,4. 基因工程药物,干扰素 抗病毒（流感病毒、HBV、HIV等），防治癌症,罗荛愫 （IFN-2a）,（IFN-1b）,（IFN-2b）,32,4. 基因工程药物(疫苗),33,4. 基因工程药物(疫苗),34,1. 酶工程概述,(1)酶的认识过程,(2)酶工程发展概况,35,2. 酶工程的内容,(1)酶的来源 化学合成法 提取法 发酵法,(2)酶的生产菌

9、对菌种的要求 生产菌的来源 常用的产酶菌,36,2. 酶工程的内容,(3)酶的分离纯化 细胞破碎 酶的提取 离心分离 过滤与膜分离 浓缩和干燥 酶的纯度与酶活力测定,37,2. 酶工程的内容,(4)酶分子的改造 酶分子修饰 生物酶工程,(5)酶与细胞固定化,38,细胞工程,细胞工程（cell engineering） 应用细胞生物学和分子生物学的方法， 在体外条件下进行细胞的培养、繁殖，或人 为地改变细胞的生物学特性，从而达到改良 生物品种和创造新品种，加速繁育动、植物 个体，或获得某种有用物质的过程。,39,1. 细胞工程的基本内容,(1)细胞工程的操作对象,原核细胞 细菌、放线菌 真核细胞

10、 酵母菌、动物细胞、植物细胞,40,1. 细胞工程的基本内容,(2)细胞工程的基本操作,无菌操作 杀菌和消毒 物理法 化学试剂 抗生素 超净工作台,41,1. 细胞工程的基本内容,(2)细胞工程的基本操作,细胞培养技术 培养基 培养板 / 瓶 / 皿 培养箱,42,1. 细胞工程的基本内容,(2)细胞工程的基本操作,细胞培养技术,43,1. 细胞工程的基本内容,(2)细胞工程的基本操作,细胞融合技术 制备原生质体 诱导细胞融合 化学法 物理法 生物法 筛选杂合细胞,44,2. 植物细胞工程,(1)植物组织培养,1920年，德国著名植物学家Haberlandt首次提出“植物细胞全能性”的概念，并

11、用叶肉细胞进行离体培养。由于取材及技术上的原因，并未成功。,45,2. 植物细胞工程,(1)植物组织培养,1934年，美国人White用番茄根为材料，建立了第一个能无限生长 的植物组织。,46,2. 植物细胞工程,(1)植物组织培养,1951年，Skoog等人进行腺嘌呤诱导离体烟草茎段上根、芽等器官的形成，获得成功。,1958年，美国Steward等和德国Reinert 等分别由培养的胡萝卜根细胞诱导形成了胚状体，并形成新植株，用实验证明了植物细胞的全能性。,47,2. 植物细胞工程,(2)植物细胞融合,去细胞壁 机械法 酶法：真菌纤维素酶,原生质体融合（细胞杂交） 物理法：离心、振动、电刺激

12、 化学法：PEG,48,2. 植物细胞工程,(3)转基因植物技术,49,2. 植物细胞工程,(3)转基因植物技术,生物药品 药用蛋白：疫苗、抗体、细胞因子等 优点：产量高、成本低、 可作食品直接服用,50,2. 植物细胞工程,(3)转基因植物技术,转基因食品 1994年5月18日，美国FDA正式批准了第一种转基因食品西红柿上市。,51,2. 植物细胞工程,(3)转基因植物技术,转基因食品,52,2. 植物细胞工程,(3)转基因植物技术,转基因食品,53,2. 植物细胞工程,(3)转基因植物技术,工业用酶 消化酶 乙醇分解酶 -淀粉酶,54,2. 植物细胞工程,(3)转基因植物技术,转基因农作物

13、（GMC） 19962001年全球GMC种植面积增加了30倍。 2001年，全球GMC的种植面积达4420万公顷：大豆46%，棉花20%，油菜11%，玉米7% 。 我国GMC种植面积在13个国家中居第四位，其中，国产转基因抗虫棉在2001年就种植了60万公顷，可以减少农药使用量70%80%。,55,2. 植物细胞工程,(3)转基因植物技术,转基因农作物（GMC） 第一代GMC：抗虫、抗病、抗除草剂等； 第二代GMC：改良作物品质，如“金稻米”。,56,2. 植物细胞工程,(4)植物次生代谢物的生产,紫草素,57,3. 动物细胞工程,(1)动物细胞/组织培养,动物细胞培养 原代培养和继代培养 贴

14、壁培养和悬浮培养 干细胞和定向分化,动物组织培养 组织工程和人工器官,58,3. 动物细胞工程,(2)动物细胞融合,1958年，冈田善雄用灭活的仙台病毒诱导艾氏腹水瘤细胞融合 化学诱导融合 电刺激诱导融合,59,3. 动物细胞工程,(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体,抗原 抗体,抗原决定簇,抗原决定簇,60,3. 动物细胞工程,(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体,多克隆抗体,单克隆抗体 MCAb,61,3. 动物细胞工程,(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体,德国的柯勒 (G. Khler，1946) 阿根廷的米尔斯坦 (C. Milstein，1926),62,3. 动物细胞工程,(3)淋巴细胞杂交

15、瘤和单克隆抗体,63,3. 动物细胞工程,(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体,疾病诊断 检测疾病相关抗原 放射性核素标记肿瘤显像,疾病治疗 针对T细胞抗原的MCAb免疫抑制剂 药物连接MCAb “生物导弹”,64,3. 动物细胞工程,(4)细胞拆合,细胞核移植 胚胎细胞核移植 1981， Illmenses克隆小鼠,65,3. 动物细胞工程,(4)细胞拆合,细胞核移植 体细胞克隆：“多莉” 1996.7.5 出生 1997.2.27Nature,66,3. 动物细胞工程,1998年2月，英国PPL医疗公司克隆牛，名为“杰弗逊”； 1998年7月，日本的若山昭彦等人成功地用克隆小鼠进行了克隆试验；

16、 2001年1月，美国克隆恒河猴 成功，名为“泰特拉” ；,67,3. 动物细胞工程,2001年3月，PPL医疗公司克隆猪成功； 2002年1月，中科院研究所陈大元研究员领导的研究小组获得国内第一头克隆牛； 2002年3月，美国成功克隆猫；,2002年4月，中国的李宁教授领导的研究小组克隆红系冀南牛 “波娃”。,68,3. 动物细胞工程,染色体移植,(4)细胞拆合,69,4. 转基因动物,2000年，法国科学家利用转基因技术“制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba”。,70,4. 转基因动物,美国弗吉尼亚技术制药工程研究院培育转基因猪，其体内含有人类的基因，产乳后其乳汁含有人体蛋白fa

17、tor 。,转基因牛Herman及她的后代，可生产人乳铁传递蛋白） 。,71,发酵工程,发酵 利用微生物在有氧或无氧条件下的生命 活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程。 发酵工程（fermentation engineering） 利用微生物的生长和代谢活动来生产各种 有用物质的工程技术。,72,发酵工程,青霉素（penicillin ） 1929年,Alexander Fleming,73,1. 发酵工程的内容,(1)发酵工程的主要内容,生产菌种的选育 发酵条件的优化 反应器的设计 产物的分离、提取与精制,74,1. 发酵工程的内容,(2)发酵工程的类型,微生物菌体发酵 微生物酶发酵 微生

18、物代谢产物发酵 微生物转化发酵 生物工程细胞发酵,75,2. 发酵工程的特点,(1)发酵过程以生物体的自动调节方式进行； (2)反应条件温和，能耗少，设备简单； (3)原料来源广泛，绿色环保； (4)易生产复杂的高分子化合物，选择性强； (5)需要防止杂菌污染，灭菌要求高。,76,3. 发酵工程的应用,(1)合成化工原料 溶剂、润滑剂、软化剂等 有机酸 (2)冶金工业 重金属的浸提 (3)酿造工业 酒类、酱油等,肺炎克氏杆菌对镉的吸附,77,3. 发酵工程的应用,(4)农、牧业 生物固氮 生物杀虫剂 微生物饲料,(5)环境保护 净化有毒高分子化合物 降解海上浮油 工业“三废”处理,78,一、生物药物的概念,利用生物体、生物组织或其成分，综合应 用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物 理化学和药学的原理与方法进行加工、制造而 成的一类预防、诊断、治疗疾病的药物制品。,生化药品 生物制品 生物医药产品,79,二、生物药物的历史与发展,第一代：远古20世纪中叶 生物体某些天然活性物质加工制成的制剂。 第二代：20世纪中后期 利用近代生化技术从生物材料中分离、纯化获得的具有针对性治疗作用的生物活性物质。 第三代：20世纪末迄今 利用生物技术生产的天然生化物质及经过生物工程手段改造的具有比天然物质更高药理活性的