生物大分子的分离纯化和鉴定.ppt

1、生物大分子通常是指在生物体内存在的或生物体 代谢产生的具有特殊生物学功能的高分子化和物，主 要包括蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类。 生物材料的选择与处理 一、选择生物材料原则： 有效成分含量高，稳定，来源丰富，保持新鲜，提取工艺简单，成本低。如：用酵母提RNA，用牛奶提酪蛋白，用大蒜提SOD(超氧化物歧化酶) 二、生物材料处理： 1、动物脏器：冰冻：-10冰库（短期保存） -70低温冰箱（数月） 干燥：可长期保存,2、植物组织：10小时内置-4 -30冰箱储藏备用 3、微生物：胞外产物（如发酵液），低温短时储藏。 胞内产物，则应收集菌体或细胞，制成冻干粉于4保存（数月不变质） 除了体液和微生物胞

2、外的某些蛋白质和多肽以外,大多数生物大分子都存在于细胞之内.,细胞破碎 1、酶学破碎法：外加酶制剂、自溶法。 2、机械破碎法：高速捣碎法、高速均浆法、高速磨珠法 3、物理破碎法：温差法、压差法、超声波 4、化学破碎法：有机溶剂法、表面活性剂（SDS 等） 金属螯合剂（Mg2+、Ca2+、EDTA）、化学变性剂。,蛋白质的分离纯化,依据蛋白质在溶液中的性质不同（溶解度、电荷、相 对分子质量的大小，特异亲和力等）确立的蛋白质和酶的分 离方法.其性质包括: 。 （1）利用溶解度差别的分离方法 1、等电点沉淀： 蛋白质在等电点时溶解度最小。当蛋白质混合液的PH值被调到其中某一种成分的PI时，该种成分蛋

3、白质将会沉淀下来，这种沉淀出来的蛋白质保持着天然构象（活性）能再溶解。高于或低于该PI的蛋白质留在溶液。 如：Glu的生产也是利用此性质进行的， Glu PI 3.22。,2、盐析 高浓度的盐（常用硫酸铵）可以降低蛋白质的溶解度。因 为高浓度盐争夺了蛋白质分子的水膜层，降低了环境中水的相 对浓度，还中和了蛋白质表面的电荷。不同蛋白质因所带电荷 和水化程度不同而在不同的盐浓度下分别沉淀出来。盐的饱和 度由低到高逐次增加，如血清中加入50%饱和度的(NH4)2SO4可使 球蛋白析出，加入100%饱和度(NH4)2SO4可使清蛋白析出，达到 分级分离的目的. 盐析后必须脱盐。 脱盐最常见的方法是透析

4、法，也可以用凝胶层析（葡聚糖凝 胶SephadexG25脱盐）、超过滤技术脱盐。盐析通常与等电点沉 淀法相结合使用。脱盐是否彻底，要经常进行检查。如除去 (NH4)2SO4可用10%BaCl2检查；除去NaCl可用10%AgNO3检查，直到 透析液中检测不出BaSO4或AgCl为止，透析完成。,3、有机溶剂分级法 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变介质的介电常数，水是高介电常数（20时，80），有机溶剂是低介电常数物质（20时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4），因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样，蛋白质分子表面的可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分

5、子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质争夺水化（膜）水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。 有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。,（二）根据分子大小不同的分离方法： 1、透析和超过滤：即利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质（如无机盐、单糖、水）等分开。,2、密度梯度（区带）离心： 蛋白质颗粒在具有密度梯度介质中离心时，每种蛋白质 颗粒降到与自身密度相近的密度梯度时停止不前，各种蛋 白质被分离成各自独立的区带。 3、凝胶过滤（分子筛层析） 根据分子大小来分离蛋白质混合物的最有效的

6、方法之 一。当分子大小不同的混和样品通过装填有高度水化的惰 性多聚体（葡聚糖凝胶Sephadex和琼脂糖凝胶Sepharose） 的层析柱时，比凝胶“网眼”大的蛋白质分子不能进入“网眼” 而被排阻在凝胶颗粒之外，比“网眼”小的分子则进入凝胶 颗粒的内部。这样，由于不同大小的分子所经历的路程不 同而得以分离，大分子先洗下来，小分子后洗下来。,（三）根据电荷不同的分离方法： 1、电泳 2、离子交换层析 （四）根据特异亲和力不同的分离方法亲和层析,层析技术,层析又称色谱法：利用混合物中各组分的物理 化学性质（分子的形状和大小，分子的极性，吸附 力，分子的亲和力，分子的分配系数等）的不同， 使各组分以

7、不同程度分布在两相中，其中一相是固 定的，称固定相；另一相是流动的，称流动相。当 流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动， 而达到分离。,（1）吸附层析： 利用吸附剂（固定相）表面对不同组分物理吸附性能的差异 而达到分离的目的。 如 硅胶G薄层层析。 （2）分配层析： 利用各组分在给定的两相中不同的分配系数而得到分离。如 纸层析。 （3）离子交换层析： 利用离子交换剂与试样中不同离子结合吸引力的差异大小不 同而得到分离。常用的交换剂有CM纤维素（弱酸型阳离子交换 剂）。弱碱型的有阴离子交换剂DEAE纤维素、改进型的CM Sephadex和DEAESephadex。 （4）凝胶层析： 利用固

8、定相的孔径对试剂样各分子（分子量大小或体积大 小）的排阻特性差异进行分离。 （5）亲和层析： 利用固定相特定配体与试样各分子特异性结合力（亲和力） 大小不同进行分离。,电泳技术 电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反 的电极移动的现象。 原理： 在一定PH条件下，不同的物质具有不同的等电 点就带不同性质的电荷，因而在电场中它们的移动方 向和移动速度也不同，可使它们分离。 颗粒在电场中移动的速度主要决定于颗粒带电荷 的量，同时受颗粒形状和颗粒相对分子质量的大小的 影响。,目前，电泳（electrophoresis）方法大致可分为 三类：显微电泳、自由界面电泳（没有支持物）及区带 电泳。以区带电泳应用比较广泛。显微电泳是用显微镜 直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程。目前已用 于研究膜结构及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。 自由界面电泳是被分离的溶质颗粒经电泳后与缓冲 溶液之间形成界面的电泳过程。利用适当的光学系统可 观察到界面的移动。在电泳过程中，每个移动界面 （峰）相当于某一特定的蛋白质。如：用于血浆蛋白成 分的电泳。,蛋白质分离纯化及鉴定,分级沉淀法与等电点沉淀法联合使用得到初步分离,脱盐（透析和凝胶过