生物光子学505.ppt

1、主讲人：刘立新 西安电子科技大学,生物光子学,第 5 章,生物光子学成像技术,2,5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势,本 章 内 容,3,5.10 非线性光学成像技术,二次谐波 (Second Harmonic Generation, SHG)显微 三次谐波 (Third Harmonic Generation,

2、THG)显微 相干反斯托克斯拉曼散射 (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering, CARS)显微 多光子激发荧光显微,4,4,1、谐波成像,二次谐波是二阶非线性光学过程，利用波长为（频率为v）激光激发非中心对称生物组织，产生波长为/2（频率为2v）的二次谐波。,5.10 非线性光学成像技术,5,SHG的特点： 光源的光谱（近红外到红外）在样品的吸收谱（蓝紫光）之外，样品没有热损伤或光致漂白； SHG只发生在非对称介质中； SHG信号是泵浦波长的一半，并很容易从泵浦光和荧光中区分开； SHG显微可用于非荧光样品和组织。,5.10 非线性光学成像技术,6,6,S

3、HG vs.双光子荧光,5.10 非线性光学成像技术,7,7,二次谐波与双光子荧光不同： 1）二次谐波产生不需要光吸收、不存在热损伤和光漂白（如果激发光位于组织吸收带以外）； 2）只有非对称性组织才能产生二次谐波； 3）二次谐波波长是准确的激发波长的1/2，而双光子荧光是宽的荧光谱； 4）二次谐波不需要荧光标记物标记。,5.10 非线性光学成像技术,8,THG是三阶非线性过程，与光强立方成正比，频率为v的输入光束会产生频率为3v的新的光束，同样也是非共振的过程（在此过程中介质既不吸收能量，也不发射能量）； 三阶效应对物质没有对称要求的限制。,三次谐波产生,9,5.10 非线性光学成像技术,9,

4、THG的优点： THG是物质固有的物理效应，是一种光和物质相互作用的多光子过程（但与三光子吸收不同，不包含介质对光的吸收）； THG没有对称性要求，可以在表面及大块组织内产生； 空间分辨率高，无需标记、没有光漂白，不会导致细胞的生理变化及细胞死亡； 信号蓝移，容易与激发光分离，信噪比高，容易与自体荧光分离； 具有单层敏感性（可用于对单分子薄膜的构象性研究）。 缺点： 需要高的峰值功率，高能脉冲辐照有损伤样品的风险。,5.10 非线性光学成像技术,10,10,谐波实验装置示意图,5.10 非线性光学成像技术,11,11,右图：老鼠尾腱（将肌肉连接在其骨骼关节处的粗硬的无弹性的纤维状组织束）的SH

5、G显微图像,5.10 非线性光学成像技术,12,组织成份中的胶原、微管蛋白、纤维素纤维等是SHG信号的主要来源。,12,人体皮肤胶原束的非线性三维成像（SHG、AUTOfl），激发波长880 nm, 垂直和水平偏振，带通滤光片：440/20 (SHG)和515/30 (autofluorescence)，标尺：Bar = 20 m.,5.10 非线性光学成像技术,13,13,14,荧光多参量和二次谐波复合成像,通过光谱分辨同时获得样品的自体荧光谱分布和二次谐波。右边五幅图像中第一幅为二次谐波成像，二、三幅表示不同波段自体荧光图像，第四幅为荧光图像，最后一幅为全部光谱(包括二次谐波和荧光)叠加图

6、像。,50m,5.10 非线性光学成像技术,双光子荧光(红色，左)和三次谐波（右）,5.10 非线性光学成像技术,15,15,背景 发展现状 应用,5.10 非线性光学成像技术,16,2、CARS显微成像,16,荧光技术的缺陷,荧光染料标记技术,非侵入光谱和显微成像技术,5.10 非线性光学成像技术,17,17,1930年诺贝尔物理奖,C. V. Raman (1888-1970),缺点 信号弱，平均入射105个光子才能产生1个拉曼光子；采集信号时间长；激发光功率高。,拉曼散射,5.10 非线性光学成像技术,18,18,拉曼散射,19,5.10 非线性光学成像技术,相干反斯托克斯（CARS）是

7、一种光学非线性频率转换的过程。当两束输入光的频率差v1-v2和分子的拉曼动态振动频率一致时，两个频率分别为v1和v2的输入光会产生频率为2v1-v2的输出光。,相干反斯托克斯拉曼散射,20,5.10 非线性光学成像技术,20,CARS信号的特点: 无需标记，非侵入式探测； 波长蓝移，频率较高，能够在较强的荧光背景条件下检测到； 信号强度大、方向性好，具有高的灵敏度； 高空间分辨率和三维层析能力，横向分辨率高于0.5m，纵向分辨率高于0.75m。,5.10 非线性光学成像技术,21,相干反斯托克斯拉曼散射是一种类似于激光的相干辐射过程，是由于介质分子振动状态的锁定而产生的。所谓振动状态的锁定是指

8、频率为v1和v2的两束相干光共同作用于介质，而使介质分子振动状态的位相之间有确定的关系，辐射的激光束有确定的方向，而且必须满足相位匹配条件才能产生的。 利用CARS光谱进行显微成像即是CARS显微成像。,21,近年来，研究人员对CARS光谱分析和显微成像技术在理论和实验方面进行了系统的研究工作，特别是美国哈佛大学谢晓亮，美国普渡大学程继新课题组，打开了单键CARS显微成像技术进入生物、医学研究领域的大门。,Maker和Terhune首次发现了相干 反斯托克斯拉曼散射（CARS）；,Begley、Harvey和Byer首先提出了CARS光谱研究技术的设想；,M. D. Duncan 等首次实现了

9、CARS显微成像；,Zumbusch等首次实现了对活细胞进行了高质量的CARS层析成像；,1982,1999,1965,1974,1974,1982,1999,5.10 非线性光学成像技术,22,22,CARS显微成像技术的典型光路配置,（a）前向探测CARS（F-CARS）光路； （b）前向探测偏振CARS（P-CARS）光路； （c）背向探测CARS（E-CARS）光路； （d）相对传输激发CARS（C-CARS）光路。,5.10 非线性光学成像技术,23,间歇期NIH 3T3 cells的F-CARS, E-CARS, and DIC 成像 C-H stretching vibratio

10、nal frequency：2870 cm-1. The pump frequency was 14054 cm-1 and the Stokes frequency was 11,184 cm-1.,J.-X. Cheng, Y. K. Jia, et al. Laser-Scanning Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy and Applications to Cell Biology. Biophysical Journal, 2002, Vol. 83, 502-509,5.10 非线性光学成像技术,24,24,(F) 2

11、D projection of 60 depth-resolved slices separated by 2m. Panels to the right and under F show the yz and xz cross sections taken at the white lines, respectively.,无毛小鼠耳朵图像，平均速度2秒/幅。表征脂CH2对称拉伸振动的拉曼位移在 2,845 cm-1 。 (A) Stratum corneum with bright signals from the lamellar lipid intercellular space th

12、at surrounds the polygonal corneocytes. Bright punctuated dots are ducts of sebaceous glands. (B) Sebaceous glands at 30m from skin surface. (C) Individual cells of the gland compartment can be recognized, with nuclei visible as dark holes (arrow). (D) Adipocytes of the dermis at 60m from skin surfa

13、ce. (E) Adipocytes of the subcutaneous layer at a depth of 100m.,C. L. Evans, et al，“Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy”，PNAS， 2005, Vol. 102,5.10 非线性光学成像技术,25,25,(A) Raman spectra of EPA and deuterated OA. (B to F) Live liver cells we

14、re treated with 0.4 mM EPA and 0.2 mM deuterated OA for 7.5 hours and labeled with monodansylcadaverine, a dye for staining degradative organelles. (B) CARS image tuned to CD2 (blue, deuterated OA). (C) CARS image tuned to CH2 (red, EPA). (D) Composite image of well-mixed CO2 and CH2 (purple) and tw

15、o-photon fluorescence from monodansylcadaverine (green). (E) and (F) Zoomed-in regions in the cell where triglycerides rich in CH2 and CD2 are colocalized within degradative compartments (stained by monodansylcadaverine and indicated by arrows).,X. Sunney Xie, Ji Yu, Wei Yuan Yang. Living Cells as T

16、est Tubes. SCIENCE, 2006，Vol. 312,利用CARS显微成像研究鱼油对脂代谢的影响,5.10 非线性光学成像技术,26,26,利用CARS成像对活细胞内细胞器运动进行动态监测,前70秒不动或小范围内动，接下来40秒与马达蛋白相连，移动8m，Scale bar:2m,5.10 非线性光学成像技术,27,27,深大T-CARS实验系统,5.10 非线性光学成像技术,28,28,钛宝石锁模飞秒激光器 主要技术指标： 脉冲宽度：120fs； 平均输出功率：1.1W； 重复频率：76MHz；,样品台,光谱仪,短波通滤光片,物镜,三维微位移台,5.10 非线性光学成像技术,29

17、,29,出射光斑（单阶模）,光子晶体光纤超连续谱发生装置 主要技术指标: 光谱覆盖范围：5001300nm； 平均输出功率：150200mW。,PCF端面,5.10 非线性光学成像技术,30,30,超连续光谱展宽效果,（a）飞秒激光脉冲泵浦光子晶体光纤获得的超连续谱的光谱分布； (b)通过800nm长波通滤光片滤除蓝移的光谱成份后的超连续谱的光谱分布。,5.10 非线性光学成像技术,31,二甲基亚砜 CH3-CH3-SO,（a）时间延迟为0ps时的CARS信号*,（b）时间延迟为1.5ps时的CARS信号*,5.10 非线性光学成像技术,32,苯甲腈,Lee Y J et al, APL 20

18、08 92:041108,实验结果,5.10 非线性光学成像技术,33,获得不同摩尔浓度的苯甲腈和乙醇混合溶液的拉曼光谱,苯甲腈:乙醇=1:5,5.10 非线性光学成像技术,34,苯甲腈:乙醇=1:1,氨基乙酸水溶液,5.10 非线性光学成像技术,35,35,牛血清白蛋白（BSA）,5.10 非线性光学成像技术,36,5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术

19、5.11 生物光子学成像技术的发展趋势,本 章 内 容,37,5.11 生物光子学成像技术的发展趋势,多功能成像： 把各种生物成像方法组合使用，各种技术的集成是生物成像的新兴领域。 一些现代的共聚焦/多光子显微镜可以提供受激荧光、荧光寿命成像和四维成像（在三维基础上加上频谱成像）。有的可以改进成各向异性成像、拉曼成像、谐波成像。,38,38,4Pi成像：一种新兴的高分辨率生物成像技术。利用相干光源在样品上产生驻波，限制了样品的发射容积。 采用双光子4Pi成像，可以同时获得横向和轴向的高分辨率。 复合显微镜：将近场和远场集成在一起来增强成像的动态范围。在同一设备的内部进行近场和远场之间的切换，既

20、可以获得高分辨率小区域范围的扫描，也可以获得大区域远场图像。 目前已有组合了近场显微家和共聚焦显微镜的商用设备。,5.11 生物光子学成像技术的发展趋势,39,39,小型显微镜：当前生物成像研究正利用MEMS技术来发展小型成像设备，另一目标是开发基于导管的人体内组织成像。内窥共聚焦、内窥多光子、光纤探头等。 超衍射极限显微成像 结构光照明（SI）显微成像 STED显微（stimulated emission depletion microscopy，受激发射耗尽显微术) PALM（ Photoactivated localization microscopy，光敏定位显微术） STORM,5.11 生物光子学成像技术的发展趋势,40,40,采用球面波前激发荧光或采用球面波前激发+收集荧光，轴向分辨率可提高7倍，可使 双光子4Pi显微术已经应用于活细胞，轴向分辨率达到80nm。,4Pi Microscopy,5.11 生物光子