无菌检查与微生物限度检查.ppt

1、2002年微生物专业委员会成立以来，我国药品微生物检验取得了革命性的进步，2005版药典明确了对检验环境的要求，对标准的制定原则引入科学的修订和检验理念等2010版药典增加了对培养基的适用性检验，包括药品微生物实验室规范指南等四个附录从人员、培养基、菌种、实验室布局和运行、设备、文件、实验记录、结果判断等方面提出了明确的要求。 山东省药品检验站，2，微生物实验室建设问题无菌检验常见问题微生物限度检验常见问题抗菌效力检验法，山东省药品检验站，3，微生物实验室建设问题，基本原则防止微生物污染事件的发生(包括环境、实验人员、试验样品等)。 有利于试验操作的进行，山东省药品检验所，4、 USP对实验室

2、的配置和运营的规定是layoutofthelabshouldenhanceoperationspreventcorss-contaminationseparationofactivitiespromotesaftylabareasho 电子游戏领域点，英国领袖抽样has growth。 allfurtherworkinthe“实时计算”areasamplingshouldtakeplacecarefullyasepticconditionsemequipmentshouldbeloadedenviroment mple andcarefullyhandledisolatortechnology

3、maybeuseful，山东省药品检验所，5，微生物实验室可以单独建设，也可以共享普通建筑，但可以单独建区，单独设1层或设1层边缘。 通往建筑物其他区域的部分必须离开门。 可分为四个区域：核心实验区、缓冲辅助区、PII级生物安全区、一般实验及准备区。 核心实验区可根据具体工作需要分为多个实验单位，核心区各实验单位最好独立运行，核心区和PII级生物安全区共有一个通风系统，不能严格控制交叉污染的发生。 各房间功能明确，不能混用。 药品检验、食品检验、化妆品检验等与无菌室共用，不得防止交叉污染。 准备室、洁净室、培养室等布局，应设置便于物品搬运、可互锁的清洁门传动窗，坚决避免直接空气交换造成交叉污染

4、。 微生物实验室的门必须尽量自动关闭，缓冲门是互锁的。 同一区域内各实验单元的门应该布置在同一方向或交替，防止直接空气交换。 山东省药品检验所、6、地面、墙面、天花板和桌子，还要传递窗户、物品台、坐台、门把手等细微环节，做到清洁、耐腐蚀、无尘、不裂、光滑防水、易消毒。 洁净室照明紫外洁净工作台等设备开关，在第1缓冲区之间以外容易设置，容易控制。 洁净室内各区域的风速、压差、温度、湿度显示等容易设置在第1缓冲区之外或第1缓冲区之外可观察的地方，容易观察记录，实时显示屏障系统的有效性。 希望在清洁区的内部和外部设置对话设备，使被试验者的情报交换和合作变得容易。 请在洁净室内设置水槽、水道、上下水道

5、等，以免微生物繁殖。 微生物实验室空调系统的修订必须充分考虑生物安全箱、恒温水浴、培养箱、冰箱、高压蒸汽灭菌器等的冷、热、湿和污染负荷。 无菌室内不应该放置水浴等对湿度有较大影响的设备，必要时可以加盖，经常换水，防止微生物繁殖是因为实验室完成后，结构布局不易改变，可以适应未来人员编制、检查内容、工作量、所需设备的修订，充分考虑实验室装载能力，必要时可以山东省药品检验所，7，山东省药品检验所微生物实验室平面图，山东省药品检验所，8，微生物实验室环境监测，保证微生物实验室安全、有效运行，有力支持实验结果的可靠性建设微生物实验室后，应配备相应的环境监测设备：浮游菌采集器，尘埃风速纠正、差压纠正过多的

6、消毒熏蒸对无菌室的通风系统管路和试验器产生一定的腐蚀，影响寿命，不合理的擦拭反而增加了无菌室污染的机会，相同的消毒剂的重复使用有可能增强微生物对消毒剂的耐性。 因此，必须根据监测情况制定适当的清扫订正计划。 山东省药品检验所，9、微生物实验室环境监测环境菌库的建立，方法定期采集洁净室沉降菌和浮游菌，适当方法鉴定收集的菌株，形态观察、生化鉴定、遗传信息分析(16sRNA测序、DNA脉冲场电泳分析等)、傅里叶红外光谱2 .判断药品检测微生物是否与环境相关菌，是否与本实验室环境菌有关。 山东省药品检验所，10、企业生产区环境菌库的建设，当企业产品灭菌条件与产品稳定性发生矛盾时，应如何做到山东省药品检

7、验所，11、解决办法：建立生产过程中重要区域的微生物监测系统，通过长期监测，建立重要区域常见的抵抗性否则，环境中监测到较强耐热菌株时，必须立即停止生产，彻底消毒。 并建立环境微生物库和实时监测体系，根据环境微生物变化规律制定相应的预防措施和消毒修订方案，并对阳性产品的污染环节进行封闭检查。 山东省药品检验所，12，FTIR法用于药品检测菌与环境菌的关联性分析、定期(月)环境菌采集、FTIR图像测定、图像累积订正、整体环境菌光谱库、当月环境菌光谱库、药品微生物检验、FTIR的D0.04、环境菌、山东省药品检验所将27株药物分离菌的平均光谱分别放入光谱库进行分析，11株的Hit值为0.04，占40

8、.7%，怀疑与环境菌有关。 其中7株从六味地黄丸中分离，检出时间： 06年9月。 带入当月光谱库分析： 5株Hit值为0.04，但当月是无菌室改造未完成时，可能是本实验环境污染。 其中4株在06年12月检出，代入当月光谱库分析： 4株Hit值均为0.04，显示这4株菌可能是外源性环境相关菌。 山东省药品检验所，14，2010年版药典无菌检验法的结果判断解读，(1)无菌检验试验所用设备及环境微生物监测结果不符合无菌检验法的要求。 (2)回顾了无菌试验的过程，发现了可能引起微生物污染的因素。 (3)在对供试品管中生长的微生物进行鉴定后，确认是由于无菌试验中使用的物品和无菌操作技术不当所致。山东省药

9、品检验所，15、微生物鉴定分析、工具书伯杰细菌手册、真菌鉴定手册形态学生物显微镜(最好有成像系统)生化鉴定手动生化鉴定试剂盒(如apiwebTM鉴定软件廉价，国际金标准，通常应配备) 全自动生化分析仪(如可实现VITKE 2大量检测)分子生物学，如16sRNA测序、荧光定量PCR等，价格高、快速、敏感、特异性、用于微生物跟踪的傅里叶变换红外光谱法Tensor27-HTSXT型微生物鉴定红外光谱仪，快速、 用于环境菌监测和微生物鉴定的初筛)、山东省药品未知微生物(来源于供试品、实验室环境、检验过程等)选择适当的培养方式进行精制培养(培养基的选择、需求、厌氧条件、培养温度振动培养是否选择等)菌落形

10、态的革兰染色和氧化酶试验、过氧化氢酶试验等(染色结果根据初步的生化试验信息和鉴定目的等选择合适的鉴定方法)生化鉴定分子生物学FTIR (或者并用几种方法)的结果分析(综合实验过程全部的信息，分析鉴定结果)的结论17，微生物鉴定分析的意义，检验中，对检测出的微生物进行鉴定分析在无菌检查法中，增加检测菌检查规定是药典发展的必然趋势。 控制菌的判断：从“应该进行分离、纯化、染色镜检查和适当的生化试验”改为“应该进行分离、纯化、染色镜检查和适当的鉴定试验”，重视微生物鉴定能力的提高是非常重要的，山东省药品检查所，18，无菌检查首次说明， 污染防治措施不能影响供试品中微生物的检测日常检查，监测环境的无菌

11、检查员必须掌握微生物的专业知识，必须接受无菌技术的训练。 新增加的三点说明表明，本版药典对药品检验机构微生物检验的综合能力和软硬件配方有更高的要求。 山东省药品检验所、19、对照品培养基、适用性检验合格的培养基可作为对照培养基，山东省药品检验所、20、对照培养基由培养基配方特别制备，是一种优质的培养基，用于培养基的适用性检验。 由中国药品生物制品检验所开发、分发。 山东省药品检验所，21、稀释液、冲洗液问题，如何选择稀释液和冲洗液，薄膜过滤法规定的总冲洗量不得超过1000ml，但对稀释液没有具体规定，稀释液的使用量多少有些容易，山东省药品检验所，22、 新版药典：“取该培养液适量转移到同种新鲜

12、培养基中，细菌培养2天，真菌培养3天，观察是否混浊于接种同种新鲜培养基。 或者取培养液的涂膜，染色，镜检，判断是否有菌。 为什么不直接进行划线培养呢？ 用液体培养物进行革兰氏染色，如何解决培养基成分对镜检观察的影响？ 根据山东省药品检验所、23、检验用菌种问题、检验试验用菌种及菌液配制培养基敏感度所用菌种，消除绿脓杆菌，增加大肠埃希菌。 验证试验实践表明，以革兰阴性杆菌为代表的绿脓杆菌在验证试验中对大多数抗生素不敏感，而大肠杆菌对以革兰阴性杆菌为主的抗生素敏感。山东省药品检验所，24，正曲霉的相关试验污染和防护问题，2005版中国药典开始使用正曲霉作为试验用菌种，但在试验中，对该菌种的安全防护

13、问题尚未得到明确有效的解决，因此，目前许多药品检验机构和制药企业还有关联山东省药品检验所，25、黑曲霉特性、生长速度快，孢子易于空气扩散。 在普通环境中生命力顽强，传统的紫外线、循环风净化和中低效率消毒剂其作用效果差，需要高效的消毒剂才能杀菌。 例如，酚酸类、酚碱类等不耐热，70左右就能杀菌。 虽然能分泌有机酸和毒素，但黄曲霉治疗人体的情况并不多见。 山东省药品检验所，26、现在实验室进行曲霉试验的常规做法：采用传统的超纯桌，关风机，接近火焰。 采用生物安全罐负压隔离器、山东省药品检验所、27、第一种由于净化台本身为非密闭性操作台，与外界环境的气流交换不可避免，对实验者、供试品或实验环境也有严

14、重污染风险的第二种方法比第一种方法在一定程度上使供试品和实验者受到污染实验后桌面消毒问题，特别是生物安全柜HEPA中丰富存在的曲霉孢子，杀菌、去除困难，成为潜在的污染源。 第三种方法是利用全封闭的负压隔离系统有效地防止微生物污染问题、有效地进行消毒剂作用。 山东省药品检验所，28，实验室根据黑曲霉的特性和自身实际制定了合理的解决办法。 山东省药品检验站、29、微生物限度检验方法的选择原则、供试液的制备方法、抗菌成分的去除方法以及细菌、霉菌和酵母菌的校正数方法，应尽量在微生物限度检验法中选择操作简便、快速的方法，并避免损伤供试品中被污染的微生物。 对于抗菌作用强的供试品，在供试品溶液的性状允许的

15、情况下，尽量使用薄膜过滤法进行试验。 山东省药品检验所、30、校正方法验证中存在供试品稀释水平的选择问题，没有适当的方法解决供试品中抗菌作用导致的微生物回收失败，可以使用微生物生长的更高稀释水平的供试品进行方法验证试验。 低稀释剂的菌落数过多，影响方法验证的结果修正算法，可以用适合方法验证的稀释级供试液进行方法验证试验。 此时，更高稀释级的供试液的确认从低稀释级向高稀释级进行，但最高稀释级的供试液的选择基于供试品应满足的微生物限度标准和菌数报告规则，如果供试品应满足的微生物限度标准为1克的细菌数不得超过1000cfu，则最高稀释级为1:10-3。 山东省药品检验所，31，有关检验订正数方法的问

16、题，如何可以选择更高水平的供试品稀释液进行方法检验和检验，山东省药品检验所，32，供试品采用常规方法检验菌落订正数结果不符合规定，进行方法检验试验？ 山东省药品检验所、33、控菌检验、新版药典中增加了“控菌检验用培养基适用性检验”检验项目。 增长促进能力、抑制能力及指示能力的检验删除“控制菌检验时的阴性菌对照组”控制菌的判断：“应该进行分离、纯化、染色镜检验和适当的生化试验”山东省药品检验所，34，控制菌检验、纺锤菌检验法：增菌培养基、培养时间、结果判断均经修订。 白色念珠菌检查加入白色念珠菌检查：阴道药加入白色念珠菌检查。山东省药品检验所、35、眼用制剂、眼用制剂微生物限度检验修订为无菌检验。 眼用制剂剂型多，基质复杂，进行无菌检查后检查品的取样量大幅增加，特别是对乳液、奶油剂、凝胶化剂