硝酸还原酶hu西北农林科技大学.ppt

1、PAS（periodic acid schiff reaction） 法显示多糖类物质,细胞生物学实验课件,一.实验目的,熟悉PAS法原理及操作步骤。 掌握PAS法显示的物质的性质，并观察多糖在组织细胞中的分布。,二.实验原理,多糖(polysaccharide)由多个单糖分子缩合去水而生成的化合物。广泛分布于动、植物界。一些不溶性的多糖构成植物和动物的骨架，如植物的纤维素和动物的甲壳素，一般称为结构多糖。另一些多糖在生物体内作为能量贮存，如淀粉（植物）和肝糖（动物）在需要时可以通过生物体内酶系统的作用分解，释放出单糖。还有许多多糖具有更复杂多样的生理功能，如粘多糖、血型物质等，它们在生物体内

2、起着重要的作用。,二.实验原理,淀粉和糖原均由D葡萄糖的分支或直链组成，过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖中的乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成两个游离的醛基(-GHO)，游离醛基与Schiff试剂反应生成紫红色产物。,二.实验用品,1.材料： 动物：肝细胞石蜡切片（鼠肝切片） 植物 ：土豆徒手切片,2.器材： 载玻片 、盖玻片、染色缸、显微镜 、小烧杯、胶头滴管、镊子,三.实验用品,3.试剂 1.不同浓度的乙醇溶液、二甲苯。 2.过碘酸水溶液：过碘酸4g、95乙醇350ml、1/5mmolL-1乙酸钠50ml，用纯水定容至500ml。配置好后，保存在04的冰箱内，瓶外加黑纸保存，此液如显黄色

3、即失效。,三.实验用品,3.试剂 3.亚硫酸水（此液中所用的偏重亚硫酸钠或钾要与Schiff试剂中所用的相同）：取10偏重亚硫酸钠（或钾）20ml、1mmolL-1 HCl 20ml和400ml纯水混匀即可。此液使用前配制，否则回因SO2逸出失效。,二.实验用品,3.试剂 4.Schiff试剂：先将纯水600ml煮沸，由大火取下，加入碱性品红3g，充分搅拌，以助于溶解，待冷却到50时，过滤到磨口棕色瓶中，加入1mmolL-1 HCl 60ml冷却到25时加入3g偏重亚硫酸钠（或钾）放入暗处，次日取出，加入活性炭3g，过滤备用，用黑纸包好，勿见光，放在低温处。一般可保存数月。,三.实验用品,3.

4、试剂 5.苏木精染液(Delafield 苏木精染液):甲液（苏木精5g、无水乙醇30ml）、乙液（铵矾即硫酸铝饱和水溶液：约1g硫酸铝：11ml水，用时配110ml,取100ml）、丙液（甘油125ml、甲醇125ml）。 配法如下：1.将甲液一滴一滴地加入乙液中，并随时用玻璃棒搅动；2.然后暴露于阳光和空气中约一周到十天；3.加入丙液；4.将混合液静置12月至颜色变深为止（可过滤），此液成熟后须置于阴冷处塞紧瓶口，可长期保存使用，使用时可将染剂一份用35份水稀释，则染色分化更明显。,四.实验步骤,二甲苯10100%乙醇3100%乙醇395乙醇390%乙醇380%乙醇370%乙醇350%乙醇

5、3过碘酸1530Schiff试剂1530亚硫酸水5亚硫酸水5亚硫酸水5自来水3蒸馏水3苏木精染液10流水冲洗50%乙醇3 70%乙醇3 80%乙醇3 90% 3 95%乙醇3 100%乙醇3 100%乙醇+二甲苯3二甲苯5。,五.实验结果,1.鼠肝细胞：细胞核呈蓝色位于细胞中央，肝糖原呈紫红色颗粒状分布于细胞胞质中，并且靠近细胞膜（远离细胞核中央）一侧聚集相对较多，呈非均匀性分布。 2.土豆切片：淀粉颗粒紫红色或粉红色，呈油滴状分布于细胞质中。,六.分析与讨论,1.关键步骤： 过碘酸起氧化作用，使两个醇基氧化成两个游离的醛基（过碘酸氧化作用时间稍长，会使反应更加充分）； 所产生醛基与Schiff试剂反应生成紫红色物质（Schiff试剂作用时间略长，会使染色效果明显，但过长将导致染色太深，也不利于观察）； 苏木精可将细胞核染成蓝色（但时间不宜过长，以免染色太重）。,六.分析与讨论,2.注意事项： 二甲苯溶解性很强，时间要把握好，前者以脱蜡为准，不要有空气；后者以透明为准，如果片子变黑，重新放回二甲苯，再透明一次。 试剂重复使用后，实验结果不明显（脱蜡不完全、染色不好等），因此在实验前要检查各试剂是否干净，如果污染严重，一定要更换。 土豆