破伤风疫苗研究进展

1、破伤风疫苗研究进展摘要：自从破伤风类毒素开始用于免疫,取得了较好的免疫效果。现在的研究主要集中在从较少量的破伤风疫苗接种,获得较高效的免疫应答方面，以此更好地预防破伤风。本文简述了破伤风的临床表现及治疗，对国内外破伤风类毒素疫苗主要研究进展和方向做一简要概述。关键词：破伤风；类毒素；免疫原性破伤风(tetanus)一词来源于希腊语，表示痉挛的意思,常发生在创伤之后。如果机体伤口被厌氧的破伤风梭状芽孢杆菌感染，该细菌就会在缺氧的环境下生长并产生外毒素而引起的急性、致死性的神经系统疾病1。因为破伤风的临床表现让人触目惊心，并且有较高的发病率和病死率,所以该病引起了人们的高度重视,并在世界范围内成为

2、医学界关注的问题。据估计,全世界每年有800 000到1000 000个破伤风死亡病例,其中新生儿占400 0002,因此破伤风是一种严重危及人类健康的疾病。该病死亡多发生在非洲和东南亚等不发达国家3。虽然在发达国家破伤风发病率较低，,但近年来,战争和自然灾难的不断发生导致外伤,烧伤，撕伤,磨伤,划伤等都可感染破伤风梭菌,使破伤风在各个国家的发病也呈上升的趋势，而且随着毒品成瘾者越来越多,采用被污染的注射器注射吸毒,也导致发生破伤风的病例在逐年增加,此外还有耳部感染，牙龈发炎,动物咬伤，堕胎，分娩，刺伤,纹身等都能引起破伤风。1. 临床裹现及治疗现状1.1临床裹现潜伏期：破伤风的潜伏期平均为6

3、10夭，短的可以仅24小时，长可达数月甚致数年。一般来说，潜伏期越短，受伤部位离中枢越近，则症状越重，死亡率越高。前驱期：常有122理小时之久，病人感觉乏力，头痛，嚼肌紧张，烦躁不安，打呵欠，少数病人感伤口有抽搐样疼痛，局部疼痛，肌肉牵拉感，抽搐及强直，感下领紧张，张口不便，颈部肌肉紧张或酸痛。.发作期：表现为肌肉持续性收缩，顺序是:咀嚼肌、面肌、颈项肌、四肢肌群和脆肌，部分病人表现为局部肌肉的收缩。病人开始感到咀嚼不便，张口困难，逐渐变为牙关紧闭，面部表情肌群则呈阵发性痉孪，出现独特的“苦笑”病容。颈项肌痉李时出现颈项强直，头略后仰，不能做点头动作。背腹肌同时收缩时，因背部肌肉力量强，以致背

4、部前屈，头及足后屈，出现角弓反张。四肢收缩时，肢体出现屈膝、弯肘、半握拳等姿态。在持续紧张的基础上，任何轻微的刺激:如光线、响声、震动、风吹、饮水、触碰、注射等都会诱发全身肌群的痉挛和抽搐。每次发作持续数分钟或数小时。病人表情痛苦，口吐白沫，沈涎，磨牙，头后仰，四肢抽搐不止，全身大汗淋离。2次发作间歇期间，痉痛稍减轻，但肌肉松弛不完全。强烈的肌肉收缩可以引起肌肉裂伤，甚致发生骨折。膀脱括约肌痉挛可以引起尿醋留。持续性呼吸肌群和隔肌痉李可以出现紫纷，呼吸停止，造成死亡。病人神志终楚，温可以升高，至可以出现热。1.2治疗现状目前对于破伤风的治疗主要是：12.1抑杀破伤风杆菌，消除毒素来源：（1）彻

5、底清除创口坏死组织，清除污染及异物，反复用双氧水及甲硝哇溶液冲洗，改善局部循环，提高组织内氧张力，充分引流，创造不利于细菌生长的条件。（2）大量青霉素和甲硝哇静脉应用，达到有效杀灭破伤风杆菌，使之不致继续产生外毒素进入体内。前者一般用量400800万单位/日。如青霉素过敏可改用其他抗生素。由于混合感染多见，故常加用氨基贰类或选用广谱强效的头抱类抗生素。（3）高压氧治疗，能有效提高血液和局部组织的氧浓度，有助于抑制细菌生长，且高压氧本身就是一个抗菌剂，增强抗生素抗菌作用及白细胞的吞噬能力，在有条件单位作为一种辅助治疗是有益的。破伤风一旦发病治疗效果不佳,目前针对破伤风通常采用控制抽搐和供应氧气的

6、支持疗法,所以预极为重要。通过免疫接种疫苗避免患病,从而降低发病率和病死率,是控制该病的最佳有效方法。因此在控制破伤风疾病中,破伤风疫苗发挥着至关重要的作用。2传统破伤风疫苗的研究进展破伤风梭菌在自然环境中普遍存在，很容易被生产中的人忽视，所以也容易通过伤口感染机体，导致发病。并且机体免疫后不能获得终身免疫力，当该菌再次侵袭机体时仍会发病，因此必须通过接种类毒素疫苗预防破伤风疾病的发生。2.1免疫程序疫苗的首次接种是在婴儿出生后满二个月，以后满四个月，满六个月，分别接种一次作为基础免疫，随后在满1520个月龄及入学前要追加一次免疫。并在1112岁时给予一次加强免疫，以后每十年都要再给予一次加强

7、免疫。成年人在未接种过破伤风疫苗的情况下，也要给予三次的基础免疫，以后每隔十年给予一次加强免疫，使机体保持持久的抗体水平，以达到预防破伤风的作用4。对于动物在满四周和满八周，分别给予4提高破伤风类毒素免疫原性的初步研究破伤风类毒素（tetanus toxoid,TT）免疫注射一次，在去势、手术、断尾、断角前的30 d给予加强免疫TT，新出生的幼畜在断脐后应给予免疫接种，预防破伤风病的发生5。以上可以看出此免疫程序较长，人们很难按时进行多次的免疫接种，尤其是在不发达国家，所以就迫切的需要治疗效果好，免疫次数少的破伤风新型疫苗。这种多次免疫注射，对于经济价值不高的家畜，如羊、猪等养殖成本太大，更不

8、适合规模养殖生产中的需要。所以单次免疫的新型疫苗是必须的。2.2破伤风类毒素的发展最初普遍使用于人免疫接种的是原制破伤风类毒素，这种类毒素免疫效果好，但接种后副反应很大，甚至有过敏休克死亡的病例。这主要是在原制类毒素中存在着大量的在培养基中水解不完全的蛋白成分，引起过敏反应6-8，为了减轻接种的副反应，对原制破伤风类毒素进行精制纯化，经过超滤、硫酸铵沉淀等方法，制备出了精制破伤风类毒素。通过疫苗的免疫使用观察，精制破伤风类毒素的接种后副反应比原制类毒素显著减少，但免疫效果不如原制类毒素。为了提高免疫效果，1940年，Holt用磷酸铝吸附精制类毒素。经过不断改进，今天世界各国基本都采用了铝佐剂吸

9、附精制破伤风类毒素，用于免疫接种。精制破伤风类毒素的生产工艺有两种：（1）先脱毒后精制；（2）先精制后脱毒。国外学者推荐采用第二种工艺，据认为前者在脱毒的过程中，甲醛极容易与毒素分子交联，以后的提纯较困难，但后者在精制过程中对操作人员存在潜在危险9，所以目前国内大多采用后者精制类毒素。自1923年，Ramon制出有抗原性的类毒素至今，破伤风类毒素应用于疫苗中主要有4种形式：（1）白喉、百日咳、破伤风三联苗（DTwP），主要接种于7岁以下儿童；（2）白喉、破伤风二联苗（DT），主要接种于对百日咳菌体成份有严重过敏的7岁以下儿童；（3）白喉、破伤风二联苗（Td），与DT相比白喉类毒素在疫苗的组成中

10、占有比例少，主要应用于成年人，因为成年人对百日咳有较强的抵抗力，对白喉也不敏感；（4）破伤风单价疫苗（TT），不被普遍采用，只有在机体有创伤时才被应用10。这些疫苗为预防控制破伤风，降低破伤风的发病率起了重要的作用。3类毒素疫苗的应用现状3.1吸附无细胞白喉、百日咳、破伤风联合疫苗（DTaP）百日咳菌体苗含有内毒素等多种有害或不必要的抗原，虽经精制但不能完全去除，为了除去这些抗原成分，消除因百日咳菌苗所引起的疼痛、发热等副反应，1981年Sato11开始用以百日咳毒素（PT）和丝状血凝素（FHA）为主要组分的无细胞百日咳疫苗，成功的减少了全菌苗引起的副反应，随后英国、美国、瑞典等国家研制各种无

11、细胞百日咳疫苗用于人群免疫。20世纪90年代以来12，对多种不同DTaP免疫效果接种反应进行临床观察，都表明DTaP与DTwP同样的免疫保护效果，副反应前者明显低于后者13。3.2破伤风类毒素微球疫苗破伤风全程免疫需要连续3次注射疫苗。在经济相对落后的地方，人们不能按时到医疗机构进行破伤风疫苗的免疫接种，每年死于破伤风的病人很多。为减少注射次数，提高接种覆盖率，开发具有长效作用的单剂破伤风类毒素控释系统是全球儿童疫苗发展计划的主要目标之一。因此WHO已经表明要重点研发出一个新的免疫方案14。以较少的免疫注射次数，产生较高的免疫应答的效果，从而为人类消灭破伤风作出贡献15。微球作为疫苗载体是近年

12、来免疫学和疫苗研究领域中的一个热点，聚乳酸是微球组成的主要成分，其用于药物载体的研究始于二十世纪七十年代中期，发展十分迅速。因为药物制成微球后，其对特定器官和组织的靶向性及微粒中药物释放的缓释性，使药物具有长期有效的作用，这些都使聚乳酸微球成为近年来缓控释剂型研究的热点。聚乳酸也是FDA唯一批准的生物降解材料，有优良的生物降解性和组织相容性。破伤风类毒素聚乳酸微球能有效地控制疫苗释放，是目前研究的主要方向。3.3亚单位疫苗破伤风毒素是由A、B和C三个片段组成的，分子量为150 ku。其中每一片段的分子量为50 ku左右。Helting用木瓜酶消化精制后，再经SephadexG100过滤，可得到

13、C片段和通过二硫键相连的AB片段，再用二硫苏糖醇还原裂解，则可得到A和B分开的片段。将A、B、C和BC片段分别免疫小鼠或豚鼠后，其中A不能诱导抗毒素免疫，B、C和BC均有免疫活性，能有效的地诱导机体的免疫应答，且可以避免其他蛋白所引起的过敏。由于B片段仍保留有毒性作用，故而一般研究最多的是C片段。但由于纯化亚单位片段需要凝胶过滤或HPLC技术，均不适合大量生产中使用16。所以亚单位疫苗在应用上受到了限制，利用适合的生产纯化方法是解决这个问题的关键。3.4基因工程疫苗破伤风毒素是一种神经毒素，由破伤风梭菌分泌产生，分子量为150 ku，由一个大质粒编码，整个毒素基因包括3 945个核苷酸。毒素经

14、菌体释放后，在蛋白水解酶的作用下，被“裂开”成一条轻链（50 ku）和一条重链（100 ku），但轻链和重链之间仍有二硫键相连17。轻链是锌依赖蛋白酶，通过水解突触囊泡蛋白-而阻断神经抑制性介质的释放。C蛋白是重链的一部分，分子量为50 ku，不具备神经毒素的活性，却保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质，是毒素的保护性抗原3。破伤风毒素C蛋白（TTC）还能将小分子蛋白靶向传递到运动神经元，所以也可作为蛋白载体促进低免疫原性抗原的免疫反应。由于C蛋白是破伤风毒素的非毒性片段，且有较高的免疫原性，因此用其作为亚单位疫苗是现代破伤风疫苗的理想选择。TTC含有大量稀有密码子，Oxer等用突变稀有密

15、码子的方法高水平表达C蛋白，诱导表达后的rTTC仍保留完整抗原性。用重组的保护性抗原免疫后，机体能产生破伤风抗体18，在国内贺华君等在用rTTC免疫后，给予100 LD50的破伤风毒素攻击，结果未见破伤风感染的任何症状19。用大肠杆菌表达破伤风毒素C蛋白，用于破伤风的预防和其他疾病的控制具有重要意义。一方面破伤风梭菌能形成芽孢形式，可造成环境的污染，同时分泌有较强神经毒性的外毒素，生产类毒素疫苗时对工作人员存在危险性。而用甲醛处理后制成的类毒素，常因含有甲醛以及大量无关蛋白，引起被接种人员的过敏反应。鉴于以上不足存在于破伤风疫苗中，采用原核细胞表达具有高免疫原性的rTTC，用于生产疫苗及免疫接

16、种，可以避免出现上述危险性和过敏反应。rTTC生产简单容易操作，适合大批量蛋白的生产，并且可以用于低免疫原性蛋白及蛋白靶向传递运动神经元的载体。可见，表达宿主中表达的破伤风毒素C蛋白，作为亚单位疫苗和促进抗原免疫反应的蛋白载体，将会很有开发前景。3.5其他类毒素新型疫苗Masanori等将重组霍乱毒素B亚单位(rCTB)与破伤风类毒素联合免疫小鼠,在给药只有对照组的1/10的情况下,仍然能诱导细胞免疫和体液免疫高水平应答。国内崔萱林等20报道,用戊二醛聚合破伤风类毒素,免疫豚鼠后平均心血抗体比常规破伤风类毒素高出约3倍,免疫马匹后抗体水平也显著高于常规破伤风类毒素。Diwan等通过羟二咪唑将葡

17、聚糖与破伤风类毒素交联在一起,从而起到缓慢释放抗原和减小注射部位刺激的副反应作用。结果显示葡聚糖磁粒承载破伤风类毒素的单剂量免疫注射可以诱导抗体水平维持在一年,而不需任何加强免疫。4展望上世纪初开始研究并应用至今的破生风类毒素疫苗,曾救治过无数人的生命,但它存在着无法克服的致命弱点:因其培养基中含有大量蛋白成分,容易引起过敏反应,且因其不能诱导机体产生终身免疫力,并且此免疫程序较长,免疫次数频繁,人们很难按时进行免疫接种,尤其是在不发达国家和不发达地区,接种覆盖面低、辍种率高。所以就迫切的需要开发免疫效果好,免疫次数少的破伤风新型疫苗。而且类毒素一般采用注射的方法免疫接种,虽然铝剂对注射部位的

18、组织有很小的副反应,但也不是很理想。为了减少这种副反应的发生,为了避免破伤风疾病的发生需要多次近十年的疫苗接种进行免疫预防,WHO已经表明要重点制定出一个新的免疫策略，达到以较少的免疫接种次数和时间,获得较高的免疫应答的效果。从而为人类消灭破伤风作出一定的贡献。参考文献:1杨东亮,叶嗣颖主编.感染免疫学M.武汉:湖北科学技术出版社, 1998, 100-1.2 CookTM, ProtheroeRT, Handel JM.Tetanus: a review of the litera-tureJ. British Journal ofAnaesthesia, 2001, 87(3): 477-

19、87.3 Farrar JJ, Yen LM, Cook TM, et a.l TetanusJ. JNeurolNeuro-surg Psychiatry, 2000, 69: 292-301.4Pan American Health Orgainization.Neonatal Tetanus Elimination.second edition,Scientific andTechnical Publication,2005,21-25.5Hostetler R I.TETANUS(Lockjaw).College of Agriculture&Home Economics.Washin

20、gton State University EB1122.6Bizzini B.Tetanusin GermanierM.Bacterial Vaccines,New York:Academic Press,1984;32.7冯洁,江丽君.减少破伤风和白喉类毒素不良反应的合理方法J.国外医学，预防、诊断、治疗用生物制品分册,1999,22(1):6-10.8汪敦胜，赵红，董树林，破伤风类毒素不良反应述评J.微生物学免疫学进展,1995,23:3179-3204.9彭祥兵.破伤风类毒素的发展历史、现状和新型破伤风疫苗的研究进展J.微生物免疫学进展,1997,25(2):54-56.10Farra

21、r J J,Yen L M,Cook T,et al.TetanusJ.J Neurol Neurosurg Psychiatry,2000,69:292-301.11Sato Y,Sato H.Development of acellular pertussis vaccineJ.Biologicals,1999,27:61-69.12Okada K,Ueda K,Morokuma K,et al.seroepidmiologic study on pertussis,diphtheria,and tetanus inthe Fukuoka area of southern Japan:se

22、roprevalence among persons 0-80 years old and vaccinationprogramJ.Jpn.J.Infect.Dis.,2004,57:67-74.13Miller E,Ashuworth L A,Redhead K.Effect of schedule on reactogenicity and antibody persistence ofacellular and whole-cell pertussis vaccines:Value of laboratory test as predictors of clinicalperformemeJ.