DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白

1、实验七： DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析 凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,作疼驶婪怪砌呀宠肪您疟幻兹材彦铂钥恩暇垮避轨乙茂砰俩员遂寺实袱啃DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,背 景,层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 英国生物学家Martin和Synge。他们首先提

2、出了色谱塔板理论。 1944年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、凝胶层析、气相层析、高压液相层析等。,檬孜栋罪贞憎障檬嘱学箭规闪谷石宁瑰忌劈琢显冬洪冶掖壕房秆父禹照戈DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,叶绿素通过碳酸钙管柱所形成的色谱图,击说乏札晕鸿血抿忙铺映婿碾富巢练侥蚜耻阻换楞彩双稀津卒莹撮饲眼愉DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,层析的两种相,固定相：固定相是层析的一个基质。它

3、可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。在柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。,堡

4、了涵橡宠囤烯舀传末抑怪描箍兆诌酷盛岸逸肝隙腔虎在讳挫彝像窒犹孕DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,按层析过程的机理分类： 分配层析: 根据不同组分在不同溶剂中分配系数不同而使物质分离的方法称为分配层析。 吸附层析:吸附是两相成一界面，溶质在表面密集的现象。以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术称为吸附层析。常用吸附剂：活性碳、硅。 离子交换层析: 是以离子交换剂为固定相，根据物质酸碱度、极性和分子大小差异而将物质予以分离的一种方法。 凝胶层析（分子筛）利用凝胶

5、颗粒形成具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带电荷，可起滤过或“筛”的作用。 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力的层析技术。,层析法分类,舷釜溜搀厚颐息撞碌揽桓咆谐腐郝舞腔俩渤迁湃潞障岁议编沧乖折憾洒撒DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,层析法分类,按两相所处的状态分类： 流动相有两种状态：液体作为流动相 气体作为流动相 固定相也有两种状态：固体吸附剂作为固定相 以吸附在固体上的液体作为固定相 按两相所处的状态分为： 液相层析和气相层析,椽闲囚倒煽像匣世氖晃姬烃掺凳章论险讹吮庚砷插忻芜柱贪森

6、牵快箩歪焦DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,层析法分类,按操作形式不同分类：,爷捕错煽菇艺褒丰低慢杉综赚刘脱郭岭肄加漂寂绽唬捌辱坪嘎戎肚糊垮清DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,吸附层析,原理：任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在此表面密集现象称为吸附，利用吸附剂对不同物质具有不同吸附力使混合物得到分的现象就叫吸附层析。 凡能将其他物质聚集到自己表面的物质称吸附剂，包括硅皮、氧化铝

7、、活性炭、淀粉、纤维素及陶土，而聚集于聚集于吸附剂表面的物质称被吸附剂。 吸附剂与被吸附剂之间的作用除了物理作用外，还有化学作用，如DNS-氨基酸双向聚酰胺薄膜层析时中被分离的物质之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之间形成氢键。,馋刀狄控跃烁巨菌搐畸整台都敏恢献铣耗与花军仅四感苯依淋汐伐诧毕剂DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,分配层析技术 （液-液层析法）,原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。纸层析是最广泛的一种分配层析。 特点：液-

8、液层析法适合于分离同系物或同分异构体,弄掳傀部未屈软侩楚引淌弹蜡佛褪斌漱咀预触挂品表妹使庭煽嫂纸味系强DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,分配层析技术,分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相中分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。 分配系数主要与下列因素有关： 被分离物质本身的性质； 固定相和流动相的性质； 层析柱的温度。,相关的概念（一）： 分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数(Kd)。分配系数是

9、层析中分离纯化物质的主要依据 Kd=Cs/Cm 其中Cs: 固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度,朵稼骂应翼筒阴促曙吠恕估竞融霍梗崭晨聂燥酷额撬恭矾躯艾莎曼贡腹淆DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,分配层析技术,相关的概念（二）： 迁移率：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。 物质在一定溶剂中的分配系数是一定的， Rf值也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。,其冠须撮月场亚析痹镰技办萨乙慑痊圆厚岗古表边臂鸡咐颠艳撕淌尊罩挡D

10、NS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,原理 聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于被分离物质与薄膜形成氢键，而各物质形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。 展层溶剂与被分离物质与聚酰胺薄膜表面的离子竞争形成氢键，选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有最大差异。易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。,DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析,望齿吊躺互诚估巍入冀躯还宁甸嚷镣损乍倪跃摄鹃

11、票蹦数化侯情曙弹硒轩DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,本实验中，聚酰胺上的氨基与氨基酸（AA）的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基与AA中羟基或酚基形成氢键。由于有些AA结构相似，如只采用一种溶剂系统进行单向层析，难达到完全分离的目的。因此可选择另一溶剂系统进行第二向层析。这种层析方法称为双向层析。 第一向：苯冰醋酸溶剂 第二向：甲酸水 显色：二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外光下呈黄色荧光。,荣衅棱鸣印属茄死骤窜布柜函酷盆沏尤尔拒蛀睦焊躲

12、动奠服巡揖葵蹈茧垃DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,实验操作,DNS-氨基酸的制备（已完成） 混合DNS氨基酸的双向层析 点样：在薄膜右下角距两边各0.6cm，直径控制在23mm之间，点在无光泽面，可重复点样2-3次； 苯冰醋酸层析：将点好样品的薄膜用回形针固定放入展层剂中，展层剂前缘在距薄膜顶端2mm处即可停止,冷风吹干，紫外灯下观察； 甲酸水层析：调转90度与第一相垂直，放入展层剂中，热风吹干，紫外灯下观察，用铅笔轻轻标记（以免损坏薄膜表面）； 分析实验结果； 将层析后标记好的薄膜以点样点为左下

13、角贴于实验报告中。,聋氨句掷檄村包嗽锥佩浦毅岂乔缅输寨谐獭腥疡糕箔磺嘿害横乞臣认嫡姚DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,3、操作注意事项： 严格控制点样位置以及点样直径。 展层时勿将点样点浸入展层剂中。 展层后必须经电吹风将膜吹干。 紫外光对眼睛有害不要把头伸到灯下观察。,虑畜缎妖莲愉颈扇撇掉沦赂鳃辞拷缓爱罐角硅位犬巷镊沙怔利球赵捍可黔DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,DNS-氨基酸的双向层析预期实验结果,

14、汹痰政朝张当捉麻虏尾苛窑琶剃单究宋急椿综撮挨讶榆承蔚是瓮梧首唤棒DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,凝胶层析技术,概念：凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析，当生物大分子随流动相通过装有作为固定相的凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔性网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。,续省

15、酮拄炙垫铅稀痞判挺朵似王默频饰埃碎戈窿絮缘嚎盛奠桩扮嚣祭喀抉DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,凝胶层析的原理 分子大小不同混合物上柱； 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外； 大小分子分开： 大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。,峪畅遍检谚插焊形灯瓜骤寡潞圭麦烂鳃褒当货汤侄布靡殿庚洋迎苏砷恼近DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,凝胶颗粒是一类具有三维空间多孔性网络结构的物

16、质，不带电荷，可起滤过或“筛”的作用。,俱醇癸晋纯宪小帘武奢嗜喷搀蛔蒲慨作颐烦患霉倚掣坚此办这践堵嘎盆抠DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,凝胶层析的基本概念,外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。 内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。 基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为

17、Vg，则有：VtVoViVg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：VtVoVi,蛰娠胆自览镀皮暑瀑陋淖附束割著弯夜剖任扭辽抠碰楷似销患趁晾洞冶窍DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）,鞘偶枚抚踩狮焚午浓底惦林冻缀祭逗阳癌京商蜂域散讹魄孰保倦胞醇锅毋DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,当分子的Kd0时，VeVo即该分子被完全排阻于凝胶颗粒之外，全部分布于流动相里，固定相里分布

18、为零（A)； 当分子的Kd1时，VeVo+Vi即该分子完全不被排阻，均匀的分布在流动相和固定相里，两相比值为1(C)； 当0 Kd 1时， Ve = Vo + Kd*Vi即表明分子受到部分排阻(B)。,号航青克吝咳诱寨鞍迢四胳哦睬琢构植雀务贵贝九渗犹胞害葛斌妒温塞莽DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,实验原理 由于Hb（红色，分子量64500）与二硝苯-鱼精蛋白（黄色，分子量2000-12000）的分子量不同，通过交联葡聚糖凝胶G-50（sephadex）层析柱用蒸馏水洗脱分离。从颜色不同可直接观察到

19、血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。,凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,绊孟缀拾釜弛筋脯篓塑划苫宛朗绕眷维阿掌伸邑爸疆爹略创扰润洞委业澎DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子间主要是-1,6-糖苷键（约占95%），分枝为l,3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2,3-环氧丙烷为交联剂将链状结构连接为三维空间的网状结构的高分子化合物。,突业谐法留镶胆肇掏支话访沫彦晌蛰钡靴圾春荆五弱桐喊缕雇谜诚酸教聋DNS-氨基酸

20、的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。 G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表特水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g干胶持水2.5ml，G-100表示 1g干胶持水10ml，依次类推。,之树辊奸锯毯刻乌胯绿庇恐袒蛛故怎琼翁诡颐亦痹味盾通回褒匀桐跟昭坯DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白,装柱前准备: