色谱基础知识及原理.ppt

1、关于色谱,色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器 常见的分离方式： 蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤 等等,色谱 是其中一种分离工具,色谱法简介,色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献 1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatography 30年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱 高效液相色谱法的广泛应用始于70年代,色谱的发明人,俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献,色谱分离的机理,分离是一个物理的过程,流动相（Mobile Phase

2、） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）,什么是液相色谱,气相色谱：流动相是气相 液相色谱：流动相是液相,什么是高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段,HPLC的仪器配置及流程,溶剂,色谱泵,自动进样器,HPLC色谱柱,检测器,废液,数据处理系统,

3、HPLC的仪器配置及流程,色谱泵,自动进样器,色谱柱及柱温箱,检测器,数据处理系统,溶剂,色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）,色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。, 色谱峰,保留时间（分）,基线 ,峰高,峰宽,响应值,液相色谱图相关术语,色谱峰 Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 峰底 Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 Peak Height 峰最大值到峰底的距离 峰宽 Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半（高）峰宽 Peak

4、Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离,液相色谱图相关术语,峰面积 Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值 标准偏差； Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半 拖尾峰 Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰 Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰 Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰,液相色谱图相关术语,基线 Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线 基线飘移 Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢

5、变化 基线噪声；N Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展 Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象,液相色谱图相关术语,死时间，t0 Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间 保留时间，tR Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间 死体积，V0 Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 保留体积，VR Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积,液相色谱应用：制备

6、型液相色谱,分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求 化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性,色谱方法转换,如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换流速,液相色谱应用：分析型液相色谱,定量分析主要基于与标准品的比较 是其最大应用领域 定性分析；不是色谱的强项 基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器 对定量及定性分析的要求 灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用,液相色谱原理 基本概念及方法开发,液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱

7、类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件,评价液相色谱方法的标准,问题：什么样的分离结果是好的？分离度？,什么是色谱的分离度,分离度的公式：,R：分离程度的量度,影响分离度的因素：K、及N,分离度方程： K 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 是分离因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素 N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度,若 N 增加 2倍 或 3倍 , R会如何变化?,分离度方程解析：柱效项,N 理论塔板数：分离效率的量度,PW = .5,PW =

8、 2,色谱柱的柱效 N,理论塔板数计算公式： Ws 方法 Wtan16切线法 Wh5.54半峰高 W3s9 3s W4s16 4s W5s25 5s,峰宽与塔板数的关系,理论塔板数,峰宽（L）,k 2，Vo 1000L,塔板数与流速的关系,流速（cm/min）,塔板数 103,分离度与 N 的关系,分离度方程解析：分离因子项,若 = 1.1 or 1.4，R 会如何变化？, 分离因子：峰分离程度的量度,分离因子：,定义： a =1 时两组分分不开， 改变a的途径 改变固定相或改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质,通过改变流动相改变，同样强度的不同溶剂 改变色谱柱,改变分离因子 的例子,若

9、= 1, 2, 10 or 20, R会如何变化?,分离度方程解析：容量因子项,K 容量因子：保留能力的量度,V0,V1,V2,V3,时间 0.5 1 2 5,k 值 k项 k对分离度影响 0 0 0 1 1/2 .50 2 2/3 .67 3 3/4 .75 10 10/11 .91 20 20/21 .95,容量因子 k 与分离度的关系,与 R 的关系,容量因子 k 与峰高的关系,改变 k 值的方法： 调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗,改变容量因子 K 的例子,谱图,、k 及 N 如何控制分离度,液相色谱原理 更进一步的探讨,离子型化合物的分离方式 多数化合物是离子型的！ 使用

10、离子交换柱：离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用反相柱 离子抑制色谱法：通过改变流动相的pH值，使样品成中性 离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中性,离子抑制色谱,离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 主要适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内,离子抑制色谱实例,而在乙腈/水并且pH=7时，多数组份保留时间很短，无法完全分离。,离子抑制色谱的使用范围,下列情况下不能使用离子抑制方法，如果： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱

11、在pH高于7时还保持离子化 可以有以下的选择 离子交换色谱 使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱，在pH高于7时用离子抑制法 使用“离子对色谱法”,在高pH值下用离子抑制,色谱柱：D18-613(聚合物基质)，室温 流动相：乙腈/0.01M NH4OH + 0.01M TBA 流 速：1.0ml/min 检 测：UV-240nm 样 品：巴比妥的衍生物 巴比妥 己琐巴比妥 甲基苯巴比妥 速可巴比妥,离子对色谱法,在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离子型化合物 离子对试剂的类型： 磷酸季丁铵（PIC A），适用于弱酸 烷基磺酸盐（PIC

12、B），适用于弱碱 烷基长度不同，形成对离子的能力不同 通常有：B5，B6，B7，B8 后面的数字是碳链的长度 磷酸二丁胺（PIC D4），适用于弱碱,离子对色谱机理,使用五烷基磺酸盐,Packing:Bondapak C18 Column:4 mm ID x 30cm Solvent:Methanol/H2O with 0.005M PENTANE Sulfonic Acid 0.5 mL/min; 25C; 5 L injection volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient:

13、 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L each,液相色谱的检测器,常规检测器 示差折光检测器（Refractive Index） 紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） 荧光检测器（Fluorescence） 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） 其他检测器（Other Detectors） 高端检测器 光电二极管矩阵检测器（Photodiode Array） 质谱检测器（Mass Spectrometry）,HPLC检测器应提供

14、的功能,对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系 但是： 由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象 并不是所有的检测器是线性的 受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距,用于HPLC的检测器,没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！ HPLC检测器可以分为： 溶质性质检测器（Solute property detectors） 对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型） 整体性质检测器（Bulk property detector

15、s） 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）,不同种类的检测器的分类,理想的HPLC检测器,高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应 对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性,灵敏度：信噪比,灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N） 检测限（LOD）：S/N = 3 定量限（LOQ）：S/N = 10 好的信噪比有利于： 更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性,6:1,N,S,方法开发的过程,Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland,

16、J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2,选择液相色谱的检测器,要考虑的因素： 你要分离的化合物/样品的化学特性 化学结构、分子量及紫外光谱等等 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） 梯度还是等度 灵敏度需求 是否有双检测的需求,选择液相色谱的检测器,通用检测器 RI ELSDMS 灵敏度mgngpg 线性范围104否103 流速敏感是否是 温度敏感是否否 破坏性否是是,选择性检测器 ABSFLEC Cond MS 灵敏度ngpgf

17、gpgpg 线性范围105103106105103 流速敏感否否是是是 温度敏感否否是是是 破坏性否否是否是,可供选择的液相色谱检测器,Absorbance (UV/Vis) Chemiluminescence Circular Dichroism (Chiral) Conductivity Electrochemical Evaporative Light Scattering Fluorescence Laser Induced Florescence Laser Interferometer Laser Polarimeter Mass Spectrometric (LC/MS),Nit

18、rogen Specific Detector Nuclear Magnetic Resonance Offline Methods Optical Rotation Detector Photo Diode Array Refractive Index Radiochemical Sulfur Specific Detector Viscometry Multi Angle Light Scattering,示差折光（Refractive Index）检测,示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初） 通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的

19、溶质 非特异性 任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值,示差检测器 基本原理,检测基于被分析物的折光指数的差异 测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别 当折光指数差异最大时灵敏度也达到最大 并不测量绝对的折光指数而是测定折光指数的差别（Differential RI） 典型的应用领域 没有紫外吸收、荧光的化合物，例如： 碳水化合物（Carbohydrates）、聚合物（Polymers） 脂肪酸（Fatty Acids）及油脂类（Lipids）,示差检测器的优、缺点,优点 通用检测器 容易使用；通常来说是比较耐用的检测器 维护成本低 缺点 灵敏度低、选择性差 对流速、

20、温度及粘度的变化敏感 不能用于梯度方法 色谱峰可能是正的，也可能是负的,示差检测器的优点 通用性,根据随机统计；任何一对液体都会有大约0.07的折光率差异 因此；除非正好被分析的样品与溶液的折光指数完全相同，都会被检测到,示差检测器的缺点 灵敏度,缺乏灵敏度 和其他检测器相比，RI检测器一般灵敏度较低,流动相：MeOH/H2O 60:40 流速：1.0 mL/min 色谱柱：C18 色谱柱温：30 C 检测温度：35 C 样品： Paraben Mixture,示差检测器的缺点 不适宜作梯度,流动相：A= CH3CN/H2O 75:25 B= CH3CN 流速： 1.4 mL/min 色谱柱：

21、NH2 色谱柱温：30 C 检测温度：35 C,Chromatography Forum: Is RI with a Reverse Phase gradient possible?By XXXXXXXXX: I have a good separation of a multi-substituted, cyclohexane that fully resolves 12 different oligomers. I can detect the components by MS, but I would like to use a standard LC detector instead.

22、 There is virtually no adsorption above 230nm and below 230nm picks up solvent interference. Im considering using RI detection and afterward subtracting a blank run. Is there any hope of this working or would I be wasting my time? ,示差检测器的缺点 对温度敏感,流动相 甲醇 0.25mL / minute 检测器温度 35C；没有使用柱温箱,吸光度（Absorban

23、ce UV/Vis）检测,目前实验室中最流行的选择 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多波长，25%是PDA） 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 吸光度与样品浓度呈线性关系 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大,吸光度检测器（UV/Vis） 优点,这种检测器简单、可靠 多数人熟悉并喜欢这种技术 可以作梯度实验并且是非破坏性的 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 一般来说灵敏度还可以,吸光度检测器（UV/Vis） 缺点,由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，

24、或使用折衷的波长 受流动相组成的影响： 用截止波长以上至少510nm作为工作波长 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响,背景吸收的影响,背景吸收降低了线性范围 多数流动相有紫外吸收,背景吸收对紫外检测器噪音的影响,UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O Blank,溶剂混合的基线噪音,色谱条件 色谱柱： C18, 5 m, 3.9x150mm at 35 C. 流动相： A: 0.1% TFA in Water. B: 0.1% TFA in Acetonitrile. 梯度： 5 - 40% B in 35 m

25、in. 流速： 1.0 mL/min. 样品： 水（10 L inj. vol.） 检测： 214 nm,为何如此重要？,五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。,基线噪音对积分的影响,荧光（Fluorescence）检测,发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子达到激发态，其返回到基态时发射光的现象即荧光,基态,激发态,S1,S0,激发 （1）,振动能（2）,发射 （3）,1. 分子在吸收UV或可见光后进入激发态，分子达到不稳定的高能量状态。 2. 电子失去过剩的能量成为振动能，并达到最低的激发单重态。 3. 电子失去能量达

26、到基态时发出荧光 共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象,荧光检测器原理,荧光检测器的应用,环境中的污染物 多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等 食品、饮料 食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素 染料 维生素及衍生氨基酸 生物技术及制药,氨基甲酸酯类杀虫剂,黄曲霉毒素,多环芳烃（PAH）,维生素,荧光检测器的优点,选择性提高 灵敏度提高（在 pg/fg 范围） 低背景技术,MDA及MDMA 柱上200pg Excitation =280 Emission =360,荧光检测器的缺点,不是所有化合物都有荧光，需要衍生 检测器对溶解气体及其他淬灭物质（如甲醇）敏感 对Ex及Em的最佳，易受温度、溶剂的极性

27、和粘度、溶剂的pH值及样品浓度影响 多数仪器的批次间差异较大，同一型号的不同荧光检测器会得到不同的结果。 有的仪器信号及噪音大于另一台23倍，光电倍增管的特征是导致这个现象的原因。,溶剂中溶解的气体对响应值的影响,浓度对芘（Pyrene）最大激发波长的影响,From: Turro, N.J., Modern Molecular Photochemistry Menlo Park CA, Benjamin/Cummings Publishing, 1978,蒸发光散射（Evaporative Light Scattering）,用氮气把流动相吹成细雾状 流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉

28、 蒸发的溶剂被从检测器中除去 溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束与光束相交 被颗粒散射的光由光电倍增管（PMT）收集 PMT的输出与溶质的存在量呈比例关系,蒸发光散射检测器原理,Evaporative Light Scattering 简称：ELSD,ELSD 优点及应用领域,通用型 比流动相挥发性小的物质都能被检测 可以作梯度实验；检测下限可到纳克级水平 对环境条件不敏感；可以使用有强紫外吸收的溶剂作流动相 应用领域： 碳水化合物 油脂及脂肪酸 未衍生的氨基酸 制药行业 表面活性剂 天然产物,ELSD 缺点,不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐） 要求使用雾化气源（典型的是氮气） 不同

29、的色谱条件下雾化及除溶剂的参数需要重新优化 破坏性技术 蒸发出的溶剂要因到户外或通风橱里 对挥发性化合物的检测不理想 一般得到的是非线性校正曲线 某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器,光电二极管矩阵（Photo Diode Array）,Photo Diode Array 简称：PDA或DAD,PDA检测器 特点,三维水平的吸光度检测器,二极管矩阵检测器是在1982年首度出现的 在整个UV-Vis带宽上检测吸光度 都需要相应的软件进行数据的分析,PDA检测器的用途及要求,光电二极管检测器可以提供许多又用的功能 光谱信息 色谱峰纯度 谱库拟合 像其他所有的UV/Vis检测器一样，需要： 高的信噪

30、比；好的线性 另外；还需要： 光学分辨率 光谱灵敏度及光谱分析软件,光学分辨率（带宽）,好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息,分辨率与色谱性能,高分辨率给出更多数据点（同样波长范围） 高分辨率有更好的线性 低分辨率的数据文件尺寸较小 宽的光学带宽可以得到更高的光通量（灵敏度）,1.2 nm,14.4 nm,PDA的优点及缺点,优点 通用的UV/Vis检测 好的选择性、线性 提供色谱峰的UV/Vis光谱图（峰确认） 可提供纯度估计 缺点 低光学通量（较窄的带宽通量） 与普通UV/Vis相比更复杂，容易漂移 灯输出能量随时间降低,质谱（Mass Spec.）作为HPLC检测器,MS：质谱（Mass

31、 Spectrometry）是一种按照分子量及其电荷分离物质的技术，经过多年的不断开发及改进，已经使质谱成为一种多功能、高灵敏度，并被愈来愈广泛使用的分析技术。 LC/MS：液相色谱与质谱的连用。需要： 除去HPLC的溶剂；产生离子；分离离子；检测离子；计算离子强度；处理数据,除去溶剂,离子化前的准备： 雾化（Nebulization） 蒸发溶剂或解吸附（Evaporation/ or Desorption） 大气压下或减压下（Atmosphere or Pressure reduction） 离子化（Ionization Ion Source）,LC-MS的离子产生,电子轰击源（Electron Impact / Electron Ionization EI） 大气压电离源（Atmospheric Pressure Ionization API） 大气压化学电离源（Atmospheric Chemical Ionization APCI） 电喷雾源（Electrospray ESI）,LC-MS技术的应用,不同离子源的流速范围,色谱的数据类型