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1、第 七 章 手 性 色 谱,姚 舜,高效分离技术（HPLC）,小颗粒+高压高速=高效,三要素：被分离物、固定相、流动相,高效手性分离技术,色谱法和电泳法是一类高效分离方法，但常规的色谱/电泳方法仍不能直接分离对映体。（为什么？） 因为在非手性环境中，对映体的分离性质（如沸点、蒸气压、溶解度、分配系数、吸附特性以及淌度）完全相同。 如何运用高效色谱和毛细管电泳分离分析对映体化合物？ 热力学/分离性质上的差异,手性分离基本策略,手性消除 采用手性试剂衍生对映体，使之转化为非对映体，利用非对映体间的性质差异采用常规分离方法分离。 构建手性分离环境 将手性分离介质引入分离器中构建手性分离环境，使得原本

2、没有分离性质差异的对映体产生分离差异。 结合高效分离技术,7-1 手性色谱技术概述,7-1-1 色谱技术分类药物研究、开发 对手性色谱技术的需求,手性药物研发不同阶段对单一手性物的需求,在新药研究、开发的不同阶段，对于制备单一手性物的需要及相关因素各不相同。,7-1-2 色谱技术分类,采用手性衍生化试剂与手性胺类、醇类、羧酸类等反应形成非对映体衍生物。非对映体对在常规色谱系统中,根据非对映体分子的手性结构、手性中心所连接的基团、色谱系统的分离效率(包括溶质分子与固定相和溶剂之间的结合力,如氢键、偶极-偶极、电荷转移和疏水性等 )的不同,而差速迁移获得分离。,1间接法（）,与直接法相比 ,手性衍

3、生化试剂法的优点,(1)使用普通的色谱柱方法成本低,分离方法灵活(可以选择正相、反相以及梯度淋洗等技术),且易于优化；,(2)由于手性衍生化试剂()分子中一般含有紫外、荧光等可检测基团,故方法灵敏度较高；,(3)有种类较多的可供选择的手性衍生化试剂(其中有些已经商品化),适用面较广。选用不同光学异构体的手性衍生化试剂,可改变对映体 (衍生产物 )的柱后流出序。 常能在大量的一种对映体存在下分离和测定微量的另一种对映体。,法的缺点,(1) 往往会出现消旋化问题；,(2) 需进行衍生化操作步骤,较费时；,(3) 要求手性衍生化试剂较高的纯度。,(4) 手性化合物对映体的化学结构中应具有易于衍生化的

4、基团 如氨基、羧基、羟基和巯基等活泼氢基团。,胺、酸和醇类手性衍生化反应的主要类型,手性衍生化试剂及反应,1. 酰化试剂 酰化试剂是由羧酸衍生的，一般手性碳原子位于羧基的位，主要用于分离胺和醇类。 应用形式： 酸酐和酰氯等,其中酰氯的反应性最强，即使是仲胺、仲羟基也能反应，但性质欠稳定。酸酐的反应性次之，可由羧酸与光气制备。,例如将氰醇酰化生成Mosher酯后，可用GC或HPLC进行分离测定。苯乙醇氰Mosher酯可用毛细管气相色谱（Durabond DB-5 ，0.330 m柱)分离测定；而4-甲氧基苯乙醇氰Mosher酯可用高效液相色谱（Nucleosil 100-5柱）分析。,外消旋样品

5、,手性衍生剂,非对映体，挥发性和吸附特性有差异,(-)-A(-)-B / (+)-A(-)-B,实例：,2. 胺类试剂 主要用途：衍生化羧酸类、N保护氨基酸、醇类药物和芳基丙酸类非甾体抗炎药、烃基丙三醇、类萜酸等。,3. 异(硫)氰酸酯类 主要用途：分离胺和醇类对映体。这类试剂与胺反应生成脲，与醇反应生成氨基甲酸酯类，反应通常在CH2Cl2、甲苯、CHCl3中进行。,4. 氯甲酸酯类 这类试剂与伯、仲胺在中等碱性的水溶液中反应生成氨基甲酸酯;与硫醇和酚反应则生成巯基碳酸酯和碳酸酯。,5.邻苯二醛(OPA)和手性硫醇 OPA在硫醇存在下，可将胺类衍生化生成异吲哚类。这类衍生物通常都具有强烈荧光和

6、良好的分离度。,手性衍生化分离机制,非对映体对衍生物是否具有良好的分离度，衍生化反应是否具有较高的选择性，主要取决于手性试剂的选择、反应产物手性基团的结构和反应生成的化学键类型。,对映体对在色谱系统中的差速迁移与下述因素有关：,非对映体分子的手性结构; 手性中心所连接的基团； 色谱系统的分离效率包括溶质分子与固定相和溶剂之间的结合力如氢键、偶极偶极、电荷转移和疏水性等。 手性中心区域有环系统或刚性结构，这些均可增加对映体对衍生物的分离度。 反应产物间的构型差异越大，分离就越容易。,2直接法,直接法可以分为两类:,手性流动相添加剂法(CMPA) 好比一只脚穿高跟鞋 一只脚穿平底鞋 （鞋和脚都在动

7、） 手性固定相法(CSP) 好比一只脚走在泥地 一只脚走在旱地 （地不动）,在液相色谱流动相或毛细管电泳的缓冲溶液中加手性添加剂（CA），CA与对映体溶质通过静电引力和氢键等非共价键结合方式，形成可逆的不同稳定性的非对映体配合物，在非手性分离器中实现对映异构体的分离。 手性添加剂是一种直接拆分法，其优点在于不需要化学衍生，也不需要特殊的手性固定相。CA必须能提供有效的基团和位置以便与溶质对映体形成非对映的配合物，也必须具有合适的结构以改善分离性能和提高其立体选择性。 常见的CA可分为手性对离子添加剂、手性配位添加剂和环糊精添加剂。,（1）手性流动相添加剂法,手性流动相添加剂液相色谱法,1).手

8、性包含复合色谱法,经常采用的添加剂是环糊精和手性冠醚。 、环糊精(CDs)分别为6，7，8个D-(+)吡喃型葡萄糖组成的环状低聚糖，其分子呈上宽下窄、两端开口、中空的筒状物，腔内部呈相对疏水性，而所有的羟基则在分子外部，其结构见图7-10。,图7-10 、环糊精结构,疏水包合区 极性作 用区,6，7，8,CDs在高效液相色谱法(HPLC)中的应用主要有化学键合的CD硅胶固定相法(CSP)及作为反相系统的手性流动相添加剂法(CMPA)。两者中不同对映体流出顺序相反。 应用特点： 前者简便有效，但价格昂贵；后者虽不及前者效果好，但价廉易行，不需特殊分析柱，两法可相互补充。,CDs的这种结构使其具有

9、能与各种极性和非极性分子、离子形成包含复合物(inclusion complexes)的独特性质。分子中多个手性中心使CDs络合作用具有高度立体选择性，可作为选择性拆分各种异构体的方法。,CDs作为CMPA还有一些重要性质，包括： 在溶液中CDs的包含作用不仅是立体选择性的，而且是可逆的； 复合物形成的速率常数与可控的扩散过程的速率常数通常为同一级，故其在溶液中的平衡相对较快，这一点很重要； 在较宽pH范围内CDs分子是稳定的；不干扰U检测，在通常用于色谱检测的全部紫外检测波长范围内无吸收； CDs无毒性。,CDs作用的基本原理 在含有CDs为流动相组分的反相系统中的复合与吸附平衡比较复杂，影

10、响对映体拆分的因素主要有： CD复合物稳定常数的差异； CD复合物在疏水固定相表面吸附的差异； 溶质分子(对映体)与吸附在反相柱表面的CD层上的吸附程度的差异。,实例：-CD拆分苯基琥珀酸,15 mmol/L-CD + 3% CH3CN + 0.05 %CF3COOH,0.30 mmol/L (2,3,6-3-OCH3) -CD +16%CH3CN +0.05%CF3COOH,Nova-pak C18色谱柱,应用CD添加剂法还分离了叔丁喘宁、环己巴比妥和氯噻酮对映体,图712 CD添加剂法分离,2).手性配合交换色谱法,常用的手性配合试剂多为氨基酸及其衍生物， 如L - 脯氨酸 、L - 苯丙

11、氨酸等。它们的光学纯度高， 易与过渡金属配位。配位金属有C u 、Z n 、N i、C d等。,配合物在生物系统中具有非常重要的作用， 如氨基酸和肽类的金属配合复合物、 酶- 金属- 底物配合物等。1979年Davankov将手性金属配合剂加入HPLC流动相中， 形成三元非对映体配合物。 由于它们结构稳定性和能量的差异， 并与固定相发生立体选择性吸引或排斥反应， 使两对映体得以分离。,3).手性离子对色谱法,基本原理： 在低极性的有机流动相中， 对映体分子与手性离子对试剂之间产生静电， 氢键或疏水性反应对映体离子对。两种非对映体离子对具有不同的稳定性， 并且在有机相与吸附固定相间的分配行为也有

12、差异， 因而得以分离。,常用的手性反离子有奎宁、 奎尼丁、 1 0 - 樟脑磺酸、 N-苯 甲酰氧基 羰基- 甘氨酰- L - 脯氨酸 L -Z G P。 被分离的药物有阻滞剂、 奎宁、 奎尼丁、 梭酸、 磺酸、 甲氟嗪、 苯丙酰苯心安等。 使用的固定相有硅 胶 ， C N , D i o l,B-： 被拆分的手性有机碱，（S）- H A+： 手性反离子,HPLC-CMPA拆分对映体的机理大致可归纳为：, 于流动相中发生立体选择性反应，如包含、配合交换、离子对等； 手性添加剂吸附到固定相表面，形成动态的液体手性固定相； 形成在流动相与固定相间具有不同分配性质或欠稳定的非对映体复合物。,总结,(

13、2)手性固定相液相色谱法,手性固定相具有很强的特征性，一个固定相往往只能拆分一类或几类对映体。 手性色谱的另一个特点是将手性固定相变成相反构型，可能会使对映体洗脱顺序颠倒过来。 研制新的手性固定相，解决不同类型手性化合物的分离是手性色谱发展的前沿领域。,过去100年：拆分约7000种手性化合物 手性色谱：已拆分近万种手性化合物 液相色谱中的手性固定相已研制100多种,常见手性固定相分类 选择基键合相（Pirkle手性固定相） 纤维素和多糖衍生物 环糊精 蛋白质键合相 合成聚合物与分子烙印手性固定相,拆分机理：氢键、-键、偶极-偶极、包合络合物、配位交换、疏水和极性相互作用的偶合。,主要优缺点,

14、优点是： 能广泛适用于各类化合物，适于常规及生物样品的分析测定； 除非必须衍生化，否则无需高光学纯度试剂； 样品处理步骤简单。 制备分离方便，定量分析的可靠性较高； 缺点是： 样品有时也须作柱前衍生（但不一定是手性衍生化试剂）， 对样品结构有一定限制，其适用性尚不及普通HPLC固定相（包括正相和反相）那样广泛。 迄今为止，CSP柱商品已有40多种，价格大多昂贵，尚未有一种具有类似ODS柱的普遍适用性。,Lux Amylose-2 Chiral column,（1） Pirkle型手性固定相,它以创始者美国Illinois大学的Pirkle W.H.研究组命名，也称-类型或Brush-Type(

15、刷型)。“刷型”手性固定相 (Brushtype CSP) 是HPLC手性固定相中非常重要的一类，这类CSP一般通过一定的间隔臂，连接一个单分子层的手性有机分子到硅胶载体上而制得，因而被称之为“刷型”CSP。 它是手性液相色谱领域使用量大，适用面广，对手性识别机理揭示较深的一类重要的CSPs。,手性固定相与手性拆分机理,此类手性手性固定相化学结构的特点是手性中心附近至少含有下列一种官能团： -吸电子或-给电子的芳香基团（在手性识别过程中发生-电荷相互作用）； 能形成氢键的原子或基团； 能发生偶极-偶极相互作用的极性键和基团； 能提供立体排斥、范德华相互作用和构型控制较大的非极性基团。,手性固定

16、相与手性拆分机理,拆分机理 三点作用原理 在手性固定相与对映体的识别过程中，至少需要两个不同的力，使对两映体按照同一空间取向吸附在固定相上，而由于对映体空间构型的不同，使得第三个力（吸引力或排斥力）作用不同，导致吸附能的不同，得到不同的保留值而分开。,三点作用模型,相互作用强，保留长，后出峰,相互作用弱，保留短，先出峰,(S)-选择子,(R)-溶质,手性识别的“三点作用” 模型,相似的相互作用力(A-A, B-B)导致色谱手性识别能力的降低或消失,对映体与CSP的三个作用力中，至少有一个力具有立体选择性即依赖于对映异构体和CSP的立体化学，而另外两个作用力必须是两种不同类型的作用力，如氢键、偶

17、极作用、作用等，否则如果存在两个相同的作用力，则可能产生不利的作用，使得CSP的手性识别能力降低或消失。例如当A-A和B-B作用力相同时，就可能使CSP失去手性分离能力(下图)。,Pirkle型手性柱分为酰胺型和脲型CSP两种结构。它一般用于正相色谱体系，以含一定量异丙醇（0.220%）的正己烷为流动相，有时也采用四氢呋喃和其它氢键受体溶剂。它也用于反相体系分离强极性溶质。 Pirkle型CSP的优点是柱效和柱容量高。,压 力,原 则,色谱柱评价,1.理论板数（甲苯） 出峰时间：2.731， 半峰高：0.11 理论板数：11036.22*4=44144.88,色谱柱评价,2.对苊的拆分能力 色

18、谱条件：流动相为正己烷：异丙醇=90：10，流速1ml/min，柱温30 进样量15l 出峰时间：11.4min，14.5min,2月19日 2月25日 3月14日,进而进行热力学、动力学深度考察,7-4-2 蛋白质固定相,蛋白质含手性氨基酸，具较大的分子量和复杂的结构，可提供许多不同的手性键合部位，利用蛋白质分子与对映体之间的立体选择性结合能将对映体分离出来。 主要有酸糖蛋白(AGP)、牛血清白蛋白(BSA)、卵粘蛋白(OVM)等，本类色谱柱通常可按反相方式操作，流动相的PH、离子强度、有机改性剂的极性和浓度、温度对于对映体的保留时间和立体选择性有较大的影响。,BSA,蛋白质固定化的方法 （

19、1）吸附法，即将蛋白质直接吸附在硅胶载体上作为CSP （2）化学键合法,蛋白质类手性固定相应用范围较广，效果良好，但该类固定相的谱柱容量较小。常用洗脱系统是磷酸盐缓冲溶液（PH47），离子强度为 0500mmol，有机改性剂不得超过 5% 蛋白质怕有机溶剂。,纤维素是D（+）-葡萄糖单元由1，4-糖苷键形成的高度有序、呈螺旋型孔穴结构的光学活性高分子。但天然的纤维素手性拆分能力不高，色谱性能也不好，难于直接由于对映体拆分。,引入新基团,对纤维素和多糖等天然手性高分子进行衍生改性，可制备性能优良的手性固定相。 三种形式：凝胶颗粒；键合固定相和硅胶涂渍。 在目前在手性液相色谱中，纤维素及其衍生物大

20、多涂渍在硅胶上使用。日本Diacel公司大量提供这类商品手性色谱柱。,7-4-3 纤维素和多糖衍主物手性固定相,如纤维素三酯衍生物，如三苯基氨基酯涂敷在大孔硅胶上用作手性固定相，能直接分离许多对映体。聚多糖的空间结构是具有一定方向的螺旋结构。 这种结构使得聚多糖表面布满了凹陷。其手性识别主要来自氨基甲酸酯或酯的部位与被拆分物之间形成氢键或偶极-偶极作用，或通过被拆分物分子立体选择性地进入这些沟槽和孔穴。,纤维素CSP用水或非水溶性溶剂作流动相，除少数例外，适用的有机溶剂限于正己烷、异丙醇、甲醇、乙醇。流动相影响对映体分离的选择性，非极性溶剂通常比甲醇/水混合液显示出更高的分离选择性。 这类CS

21、P具有应用范围广，样品容量高的优点。缺点是柱效低，有些溶质显示不可逆吸附，且多为涂渍柱，较易流失，对所用溶剂有一定限制。已报道分离氨基酸、醇、酮及各种手性药物的8085%是使用OD、OJ和AD柱.,表7-3 纤维素和多糖衍生物手性固定相,拆分外消旋1-苯基乙醇类化合物,三苯甲酸酯纤维素手性色谱柱（CHIRACEL OB ，I.D. 4.6250mm）拆分1-苯基乙醇、1-苯基丙醇、2-氯-1-苯基乙醇和2-溴-1-苯基乙醇外消旋化合物，可用于监测不对称催化氢化反应过程和测定产物对映体过剩值。（厦门大学学报，1998，37（2）：309）,R：H，Cl，Br，CH3,实例：,7-4-8/9 合成

22、聚合物与分子烙印手性固定相,合成手性聚合物CSP的制备主要通过三种途径： （1）在手性条件下不对称聚合； （2）采用手性单体； （3）手性分子烙印技术。 分子烙印(imprinting)手性固定相是在聚合过程中加入一个适当的模板(template)分子，然后从聚合物中除去模板分子，流下一个“形状选择性”(shape selectivity)孔穴，形成适合于孔穴立体选择的聚合物。,GC & TLC & CE手性拆分,CSP、CMPA、CDR 各举一例,气相手性色谱,早期的手性固定相多使用氨基酸、肽和各种他们的衍生物，后来也有使用其他的天然的手性分子如酒石酸、苹果酸、扁桃酸和菊酸，但是用环糊精衍生物制备的手性GC毛细管柱是最为成功的一类。 Armstrong 研究组在上世纪90年代初研究设计了一种既是液体又是极性的亲水性糊精衍生物，做GC手性固定相。制备成在室温下为液体、中等极性的 -，-，和-CD 的衍生物GC固定相。,O-(S)-2-羟丙基)-环糊精全甲基衍生物的制备,第一步：制备O-(S)-2-羟丙基)-环糊精首先把环糊精溶解在氢氧化