真菌感染实验诊断.ppt

1、第三章是真菌感染的实验诊断。第一节是真菌的基本特征。真菌是一大类真核细胞，具有典型的细胞核，没有叶绿素，也没有根、茎和叶。1.真菌的形态特征；1.单细胞真菌是圆形的，如酵母。(二)多细胞真菌由菌丝和孢子组成，称为丝状真菌或霉菌。菌丝和孢子的形态因细菌而异，这是鉴定真菌的重要依据。孢子分为许多种类，如叶状体、分生孢子和孢子囊。二是真菌的菌落特征，对真菌培养的要求不高。沙氏培养基(含1个蛋白胨，4个葡萄糖或麦芽糖，2个琼脂)常用于培养，适宜温度为2228，但深层真菌为37。形成三种菌落，菌落形态是鉴定真菌的重要依据。酵母菌落是单细胞真菌的菌落，形状与细菌菌落相似，体积大，表面光滑、湿润、柔软、边缘

2、整齐，如新生隐球菌。2.酵母样菌落，如白色念珠菌，形成假菌丝并将其延伸到人类培养基中。3.霉菌菌落是多细胞真菌的菌落。菌落是棉絮，产生不同的色素，如皮肤癣菌。第2节标本收集和检查程序，1。临床标本的收集(1)临床标本第1类皮肤角质物质：头发、指甲、头皮屑等。各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。3血液和体液：体液包括胸腔积液、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。4脓和渗出物。(2)标本采集注意事项：1 .应采集不同的临床标本，以适应不同的真菌感染。如果怀疑是浅部真菌感染，如体癣，则应刮掉病灶边缘的痂和头皮屑，并应将其视为癣。深部真菌感染应采取血液、脑脊液和脓汁。2.服药前采集标本一

3、般应在服药前采集真菌标本，已服药者在采集标本前应停止服药一段时间。3、标本采集量为5毫升血液和脊髓液、20毫升胸膜液、2片头皮屑标本和2片活体组织(一片用于病理检查，另一片用于镜检和培养)。4、严格无菌操作和消毒处理，特别是采集血液和脑脊液标本，避免杂菌污染。5.收集样品并立即送去检查。深层真菌的最长标准不得超过2h。第三节真菌检查。直接检查标本，1。在真菌疾病的诊断中，直接显微镜检查比细菌检查更重要。许多真菌标本可以直接在显微镜下检查，不需要染色。例如，癣标本常采用湿氢氧化钾试验法，即取患病或受损部位的头皮屑和指甲屑，放在载玻片上，加入一滴10-20%氢氧化钾溶液，然后加入盖玻片，稍加加热，

4、使标本组织溶解透明，显微镜下可观察到真菌的孢子和菌丝。直接镜检的意义，阳性直接镜检的含义：诊断意义，如浅部真菌病；你看到的是真菌的形态，它可以决定某些病原真菌的属或种，如假丝酵母的厚膜孢子；判断皮肤癣菌、曲霉等真性菌株的致病性。直接显微镜检查也有局限性：阴性结果不能排除真菌感染；有假阳性结果。因此，直接显微镜检查的可疑结果应通过其他检查方法进行审查或识别。(2)常用的抗原检测方法有乳胶凝集试验、酶联免疫吸附试验和半定量放射免疫分析法。应该设置控件来防止假阳性和假阴性。用乳胶凝集试验检测白色念珠菌甘露聚糖抗原。采用乳胶凝集试验和酶联免疫吸附试验检测血清和脑脊液中的隐球菌多糖荚膜抗原，治疗前该抗原

5、非常敏感和特异。用半定量放射免疫法检测血清、尿液和脑脊液中的荚膜组织胞浆菌循环多糖抗原，可用于快速诊断注意以下几点：菌落性质：酵母或霉菌；菌落大小，致病真菌菌落小，而条件致病真菌菌落大；菌落颜色病原真菌颜色浅，污染真菌颜色深；致病真菌菌落下沉，有时会使培养基破裂；被污染的真菌菌落不会下沉，也很少会导致开裂。3。真菌的生化反应，主要用于深部感染真菌如假丝酵母、隐球菌等。1.糖(酒精)发酵试验37孵育，观察糖发酵。2。同化碳源实验将含有细菌的生理盐水与熔化的固体同化碳源培养基(45)混合，然后分别向培养基中加入糖，并在25观察培养结果。如果24小时后没有变化，可以重复添加糖。如果它周围有一个增长圈

6、，就不会有增长。3.同化氮源的试验与同化碳源的试验相同，但需要无氮源的培养基，并添加硝酸钾代替糖。4.动物实验的目的是分离致病真菌，确定真菌菌株的致病性和研究药物对真菌的作用。例如，当念珠菌属。接种于家兔或小鼠后，肾脏明显肿胀，肾皮质出现白色脓肿。5.核酸检测：医学真菌的鉴定方法引入了分子生物学的鉴定方法，从核酸碱基的G C mol分析、限制性片段长度多态性(RFLP)、Southern印迹分析到脉冲场凝胶电泳(PFGE)、聚合酶链反应指纹图谱、随机扩增多态性DNA(RAPD)和DNA特殊片段测序。(1) G Cmol分类鉴定法，常用热变性温度法。原理是DNA的热变性打开碱基的氢键，双链螺旋变

7、成单链，导致核苷酸碱基在260纳米处的紫外吸收明显增加。当它完全变成单股后，紫外线吸收的增加就停止了。紫外吸收增加的中点温度是热变性温度(Tm)。如果真菌DNA中G-C碱基对的含量高，Tm值就会高。它可以直接反映G-C碱基对的绝对含量。公式为G Cmol=(Tm-53.9)2.44。(2)真菌核型的脉冲电泳分析和脉冲凝胶电泳解决了真菌大分子DNA分离的技术难题。原理：在脉冲电场发生器中，两个方向的电场在设定的脉冲时间内交替变化，使大分子DNA在运动的同时不断改变其形状和迁移方向，从而绕过微小的凝胶孔而被分离。较大的脱氧核糖核酸分子游得慢，而较小的分子游得快。影响电泳条带模式的因素很多。建议使用

8、较低的电压和较长的脉冲时间来分离高分子量的脱氧核糖核酸，如真菌。利用聚合酶链反应分析真菌的核型，可以直接比较它们的遗传背景，从电泳核型的差异中进行分类和鉴定，获得基因结构的基础数据，构建大规模的物理图谱。随机扩增多态基因(RAPD)分析，RAPD分析是一种技术，使用单个寡核苷酸引物随机合成扩增目标细胞的基因通过聚合酶链反应，然后分析多态性的大小和数量的脱氧核糖核酸片段通过凝胶电泳，从而与目标基因进行比较。由于病原真菌基因组庞大，RAPD分析适用于真菌的鉴定和分类。第六，真菌毒素的检测，真菌产生有毒代谢物，可引起急性和慢性真菌中毒，引起消化道中毒症状，并可进入人体引起病变，如黄曲霉毒素和曲霉毒素，从而引起肝损伤；瓜氨酸导致肾脏损伤；黄绿色青霉素对中枢神经系统等造成损害。有些毒素是致癌的，如黄曲霉