基因工程与基因组学

1、2003.8,遗传学,第九章,基因工程与基因组学,2003.8,遗传学,第一节 基因工程,概念：利用DNA重组技术，把一个细胞中的基因转移到另一个细胞中，并使该基因控制的性状能够正确表达，这项技术称基因工程（gene engineering).,2003.8,遗传学,细菌的接合：,2003.8,遗传学,1.原理： 噬菌体转导,U形（戴维斯）管实验： 1950年，Davis,B设计， A: trp- his+ B: trp+ his- 混合培养后，10-7细胞 得到100个trp+ his+ 。 没有接合，怎么而来？,2003.8,遗传学,研究结果：,是一种温和型噬菌体（P22）携带的结果。 噬

2、菌体：称可过滤因子。 概念：以噬菌体为媒介，把一个细菌的基因导入另一细菌，这一过程称转导（transduction).,2003.8,遗传学,烈性噬菌体：T2, T4,2003.8,遗传学,温和型噬菌体： , P1, P22,2003.8,遗传学,亮氨酸转导,2003.8,遗传学,这就是天然基因工程（基因转移）过程!,2003.8,遗传学,2. 几个概念：,供体（donor)：品系甲，提供基因； 受体（recepter)：品系乙，接受基因； 目的基因（target gene)：被转移的基因，亮氨酸； 载体(vecter)：噬菌体，携带基因； DNA重组（recombination)：噬菌体插入

3、大肠杆菌的过程，目的基因与载体结合；,2003.8,遗传学,几个概念2,限制性内切核酸酶（restriction endonucleases)和连接酶：DNA切开与连接； 感染（infection)： 载体进入受体的一种方式； 转化、转导等。 基因繁殖且表达。,2003.8,遗传学,3. 基因工程的主要步骤：,. 目的基因获得： 物理分离法； 化学合成法； 酶切（鸟枪射击）法； 逆转录法； 噬菌体摄取法； 基因组克隆法等,2003.8,遗传学,. 载体与DNA重组,合适载体；质粒、噬菌体、转座子等 限制性内切酶； 连接酶；,2003.8,遗传学,重组1,2003.8,遗传学,重组2,2003.

4、8,遗传学,内切酶,2003.8,遗传学, 把重组DNA分子送入受体：,转化： 转导； 基因枪 注射； 其它一切介导方法。,2003.8,遗传学,转化,2003.8,遗传学,注射,2003.8,遗传学,电激,2003.8,遗传学,基因枪,2003.8,遗传学,脂质体示意图,2003.8,遗传学,脂质体,2003.8,遗传学,4. 基因工程的成就：,1.三大支柱：干扰素、人的脑激素、胰岛素 2. 人的抗凝血因子转到羊身上； 3. 抗虫：Bt基因、胰蛋白酶基因、 4. 抗病：抗病毒基因,2003.8,遗传学,5. 基因工程要做些什么？,1. 固N； 2. 大豆蛋白基因转到水稻中； 3. 动物蛋白基

5、因转到植物中； 4. 疫苗抗原转到植物中； 5. 新的抗病虫基因转到新品种上； 6. 大象的生长基因转到猪身上； 7. 观赏新类型；等等,2003.8,遗传学,第二节 基因组学,概念：研究生物体全基因组的分子结构和遗传功能的学科称基因组学（genomics)。 结构基因组学（structural genomics)：以分析测定基因组核苷酸序列为主要目的的基因组研究； 功能基因组学（functional genomics)：研究全基因组的基因及其功能，又叫后基因组学（post-genomics)。,2003.8,遗传学,基因组计划（genome project)：,研究一个基因组的全部工作的规划

6、： 1.测定全部DNA序列； 2.构建基因组的物理图谱； 3.构建基因组的遗传图谱； 4.构建基因组的转录图谱； 5.分析基因组的功能。,2003.8,遗传学,目前实施的基因组计划：,微生物：大肠杆菌、噬菌体、酵母 植物：拟南芥、水稻； 动物：果蝇、猪、牛、鸡等； 人。,2003.8,遗传学,例：人类基因组计划（HGP, human genome project）,1986.3.7 美国一个叫dulbecco在Science 上发表一篇文章：“肿瘤研究的一个转折点：人类基因组的全序列分析”。人有310 9 bp，工作是浩瀚的。 1990年，美国国立卫生院对“人类基因组计划”立项，拨款30亿美元

7、。 2000年，完成人的基因组草图，完成结构基因组学。 2005年，完成功能基因组学。,2003.8,遗传学,HGP的目标,1. Generate sets of full-length cDNA clones and sequences that represent human genes and model organisms. （分析出代表人类全部基因和模式生物的全长cDNA克隆和序列）。 2. Support research on methods for studying functions of nonprotein-coding sequences（产生一种方法用来研究非蛋白编码

8、序列的功能）。 3. Develop technology for comprehensive analysis of gene expression（研究一些技术用来理解和分析基因的表达）。,2003.8,遗传学,4. Improve methods for genome-wide mutagenesis（研究一些技术用来研究整个基因组的突变产生）。 5. Develop technology for large-scale protein analyses. 研究蛋白质大规模分析技术。,2003.8,遗传学,显微镜下人的染色体,2003.8,遗传学,人的染色体组,2003.8,遗传学,HG

9、P与中国,1998年8月11日，中科院遗传所“人类基因组中心”成立。 1999年2月，中心决定进行大规模基因组测序，以创造加入“国际测序俱乐部”的条件。同年7月7日，中国在国际人类基因组测序协作组登记，申请加入“国际测序俱乐部”。 并承担了1%的染色体测序任务。,2003.8,遗传学,中国的基因组工作室,2003.8,遗传学,我国的工作人员正在测序,2003.8,遗传学,HGP实验室（图）,2003.8,遗传学,中国基因组人员在工作,2003.8,遗传学,一、建立DNA（cDNA)文库,创造人的46个染色体的DNA文库，该DNA是工作的材料。测序可能要做若干次重复，因此，要有一定数量的DNA做

10、原料，即，可克隆的DNA片段（clonable Fragmant）。 DNA文库有cDNA（complementary DNA）文库和gDNA(genome DNA)文库两种。,2003.8,遗传学,1. 取材,选取的原始个体不同，DNA文库的基因序列，DNA序列肯定不同。白种人、黄种人、黑种人、不同地区的人，选什么人，研究者有他们的想法，可能是科学家，也可能是他们自己，更可能是随机取样；,2003.8,遗传学,2.文库的建立,DNA文库技术 RH（Radiation Hybrid） YAC(yeast Artificial chromosome) BAC(Bacterial Artifici

11、al chromosome) PAC,cosmid,fosmid等.,2003.8,遗传学,RH （Radiation Hybrid）方法,将人的细胞（染色体）用X-光照射打断染色体，该细胞与鼠细胞融合，使DNA片段能插入到鼠的染色体上，扩增的细胞株中的人DNA片段(5-10Mb),得到克隆（也有STS出现），用作分析。,2003.8,遗传学,YAC（Yeast Artificial chromosome）方法,利用酵母染色体结构和复制系统（着丝点、端粒、复制子）来复制人的DNA分子；可克隆2002000kb的DNA； 特点：克隆片段大，可达Mb级别，用作自动分析材料。,2003.8,遗传学,

12、pYAC,2003.8,遗传学,BAC（Bacterial Artificial Chromosome ）：,把人的染色体片段嵌入细菌的质粒（F质粒）中，可运载扩增100300kb DNA。 特点：较小，便于普通测序。但自动测序时显得小。,2003.8,遗传学,PAC文库,PAC(P1-derived Artificial chromosome）是P1噬菌体为载体的DNA文库。可以看出，PAC肯定较小，携带90-150kb 的DNA。Loannou将PAC用于人基因组，构建了12万个插入片段，长度为110-120kb，容量是人基因组的3倍。 1200001101000=1.321010/（31

13、09）=4.4倍，保守即约为3倍。,2003.8,遗传学,TAC 文库,TAC(Transformation-competent Artificial chromosome)叫可转化人工染色体。 载体是pYLTAC7(p1质粒和Ri质粒），可用于植物。,2003.8,遗传学,HAC文库,HAC(Human Artificial chromosome)叫人类人工染色体。,2003.8,遗传学,二、DNA序列测定原理,将DNA片段用荧光等分析仪，测出DNA序列碱基排列顺序。 DNA 序列测定方法： 1.化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应和C反应； 2.Sanger的双脱氧法：A/T/G/C

14、四个反应。 3.自动测序法,2003.8,遗传学,1. Sanger 的测序方法,CGCTCAGC TGGTGATT GTGT,2003.8,遗传学,Sanger,2003.8,遗传学,2.连续测序法,一轮 随机引物 二轮 测出的序列 作为二轮的引物 三轮 测出的序列 作为三轮的引物,2003.8,遗传学,三、测序-及连接方法的遴选,对文库中的各片段逐一测序，测序后的连接则是一个巨大的任务（生物信息学）。目前有两种思路： 1. 第一种是全基因组散弹法（whole genome shut-gun)：即从文库中随机取，然后分析，分析后再根据碱基序列进行拼接，由Celera提出。 步骤：取全基因组D

15、NA 纯化酶切或超声波打断 电泳 回收DNA片段 构建质粒文库 转化宿主菌 扩增培养 提质粒DNA为模板进行PCR测序 上测序仪处理测序数据补缺 完整基因组序列。,2003.8,遗传学,. shutgun法,2003.8,遗传学,2. 层次散弹（hierarchical shutgun）,第二种是层次散弹（hierarchical shutgun）。即把大的基因组先进行分层，如染色体编号、染色体下片段编号、小片段上作物理标记，然后再对小片段测序，这样使最后“拼接”变得容易得多。,2003.8,遗传学,测序的两种思路,2003.8,遗传学,四、建立物理图谱和遗传图谱, 染色体编号 先将各个染色体

16、分离，编号：1#，1#，2#，2# 以染色体为单位甚至更小的单位用shut-gun方法再进行测序。,2003.8,遗传学,路标技术,在不能切割成小片段进而编号时，一条染色体上要设计几个标志，相当于编号，称路标技术（Landmark），这个路标是有顺序的，路标愈多，之间的距离愈近，路标图谱愈精密。，目前的路标有： i STS 标志 ii EST 标志 iii SNP标志 iv RFLP 、 FLAP标志（酶切点标志） V SSR标记,2003.8,遗传学,：STS,STS路标：STS（Sequence Tagged Site）是物理路标，如用激光切的染色体上DNA段。 当人的染色体片段在鼠的细胞

17、中，其标记是STS。STS可以较粗（长），也可以更细（短）。,2003.8,遗传学,ii：EST路标,EST标签：EST（expressed sequence tag）叫表达序列标签，实际上是遗传图谱，即已知的某一基因序列。用cDNA短片测序后，可做为EST标签。显带法和其他基因定位法鉴别的可表达基因位点也是EST。,2003.8,遗传学,iii：RFLP 标志,RFLP（Restricfion Frafment length polymophism）叫限制性片段长度多态性。由于多态性，同一种酶对同一区DNA（不同个体）进行处理，会得到不同的长段的区带，这个酶切位点一般是一定的，因此，其片段也

18、是相同的。 不同的内切酶处理，可得到不同限制性片段，因此有不同长度的文库。可用来进行测序结果的比较。,2003.8,遗传学,不同的RFLP,酶A 酶B,2003.8,遗传学,电泳图,2003.8,遗传学,iv：SNP路标,SNP（single nucleotide polymorphism）叫单核苷酸多态性。指基因组中核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。包括单碱基转换、颠换、插入/缺失等。SNP位点极其丰富，在人的基因组中，每1000bp就会有1个SNP，这样人的基因组中有300万个SNP。,2003.8,遗传学,SNP,2003.8,遗传学,五、功能基因组计划：,1. 遗传图谱分析对应

19、； 2. 分子标记确定基因位置和功能； 3. 反求遗传学（人为创造突变体）； 4. 其它方法。,2003.8,遗传学,高速离心,2003.8,遗传学,中国的HGP实验室（图注）,1999年9月，中国获准加入人类基因组计划，负责测定全部序列的1%。坐落在北京顺义空港工业园B区的中科院遗传所人类基因组中心承担了1%主要测序任务。1999年4月至今，被实验人员成为“元老”的中心的第一台计算机仍在24小时运行。图为这台计算机上摆放着三根玉米棒，旁边有一行字：穷棒子精神永远光芒。,2003.8,遗传学,中国基因组人员在工作,2003.8,遗传学,1999年9月，中国获准加入人类基因组计划，负责测定全部序

20、列的1%。坐落在北京顺义空港工业园B区的中科院遗传所人类基因组中心承担了“1%”主要测序任务。图为2001年5月，他们从美国引进的三十台世界上最先进的基因测序仪。这使中国的基因测序能力提高了五倍，超过了原来领先于中国的德国和法国，仅次于美国、英国和日本。,2003.8,遗传学,1%的测序任务弃掉1200万只枪头,2003.8,遗传学,2000年公布人的基因组草图,德国教育和科技部长在公布人的基因组草图测序结果2001.2.13,2003.8,遗传学,国家主席江泽民2001.11.28在北京会见来华参加“人类基因组测序第十次战略会议”的科学家,2003.8,遗传学,中国科学家完成水稻图谱,2003.8,遗传学,第三节 基因诊断,又叫分子标记诊断。 限制性片段诊断。,2003.8,遗传学,例：,1 2 3 4 5 一个DNA（正常），若有某一内切酶4个切口，它将产生5个片段；若1最短，5最长，电泳后：,2003.8,遗传学,限制图谱