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1、DNA探针,王艳慧,什么是DNA探针 DNA探针是利用同位素、生物素等标记的特定DNA片断, 该片断可大至寄生虫基因组DNA，小至20个碱基。,原理,当DNA探针与待测的非标记单链DNA（或RNA）按碱基顺序互补结合时，以氢健将2条单链连接而形成标记DNA-DNA（或标记DNA-RNA）的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后用检测系统（放射自显影或酶检测等）检测杂交反应结果。,优点,这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。 DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。 DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、

2、PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。,双链DNA探针的合成方法,切口平移法 随机引物合成法,切口平移法,当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从53的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。,切口平移反应受几种因素的影响,(a) 产物的比活性取决于-32 PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。 (b)DNA酶的

3、用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。 (c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。,注意,1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用-32 P-dNTP。 2、DNA酶的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。,随机引物合成法,随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。,利用随机引物进行反应的优点

4、是：,(1)Klenow片段没有53外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。 (2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。 (3)反应产物的比活性较高,可达4109 cpm/g探针。 (4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。,注意,1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针. 2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。,单链DNA探针的合成方法,以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针; 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针,末

5、端标记DNA探针,(1)25l反应体系中用合适的限制酶酶切1g的DNA。 (2)按下列成分加入试剂并混匀： 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10末端标记缓冲液 5ml 2mmol/L 3种dNTP 1ml a-32P-dNTP 适量 加水至 50ml (3)加入1单位的Klenow片段,室温下反应30分钟。 (4)加入1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液, 室温保温15分钟。 (5)70加热5分钟,终止反应。 (6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用Sephdadex G-50柱层析分离标记的DNA。,注意事项,1、利用本方法可对DNA分子量标准进行标记，利用它可定

6、位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA片段。2、对DNA的纯度不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。 3、末端标记还有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶标记脱磷的5端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该酶进行交换反应标记5末端。,DNA亲子鉴定,DNA是从几滴血, 腮细胞或培养的组织纤内提取而来。用畴素将DNA样本切成小段, 放进喱胶内, 用电泳槽推动DNA小块使之分离最细的在最远, 最大的最近。之后, 分离开的基因放在尼龙薄膜上, 使用特别的DNA探针去寻找基因, 相同的基因会凝聚于一, 然后,利用特别的染料,在X光的环境下, 便显示由DNA探针凝聚于一的黑色条码。小孩这种肉眼可见的条码很特别