03第三章 吸附层析.ppt

1、第三章吸附层分析、吸附层分析(adsorption chromatography)也称为颜色层法或色谱法(Adsorption Chromatograph Y)。目前，牙齿方法已被用作纯化或鉴定各种化合物的重要手段。1903年，俄罗斯植物学家茨维特首先将磷酸钙粉末放入玻璃管，做成圆柱形，然后倒上从石油醚中提取的植物色素溶液，使其通过碳酸钙柱，然后用石油醚发现清洗。各种颜色层可以徐璐分离，柱顶是黄色，柱底是绿色，这就是初始吸附层分析，固定床“床”形式：柱子。第一节吸附柱层分析，吸附柱层分析：以固体吸附剂为固定相，有机溶剂或缓冲液为流动相，形成柱的分层分析法。常用吸附剂有极性和非极性两种茄子极性，

2、即羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人工沸石等，非极性：活性炭等。一，经常使用的术语，一固定床固定床由分层基质组成。气质包括固体物质(如吸附剂、离子交换)液体物质(如纤维素或硅胶固定溶液)牙齿，这些物质可以与相关化合物可逆吸附、溶解和交换。2流动相在分层分析过程中，固定相的物质向特定方向移动的液体或气体称为流动相。分析柱层时，流动相也称为洗涤剂或洗涤剂(即有效成分或杂质在一定程度上移动的溶液)。在薄层色谱中，流动相也称为展示剂。三层分析将基质作为固定相(柱或薄层)，以液体或气体作为流动相，有效成分和杂质在牙齿上连续多次分配、吸附或交换，最终结果是分离混合物。4工作容量是在特定条件下，某些成分和气质反应

3、平衡时气质中存在的饱和容量。一般用克(或毫升)气质和某些成分的毫摩尔数或毫克数组合来表示。(mmol/g，mg/g，mmol/ml，mg/ml)数值大，表明气质能很好地结合某些成分。否则。5床体积(Vt)通常表示膨胀的基质在层柱中所占的体积(Vt)。Vt表示气质的外部体积(V0)和内部体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和3360 Vt=V0 Vi Vg(见图3-1)，6洗脱体积(Ve)洗脱体积由柱顶部到底部表示特定成分(Ve)，7外体积(V0)外体积表示基质颗粒间体积的总和。8耐水体积(Vi)耐水体积是基质颗粒内部体积之和。9气质体积(Vg)气质体积是指气质本身的体积。V0，Vi，Vg都随床

4、体积和气质性质的变化而变化。10膨胀率在一定溶液中单位重量的基质充分溶解后所占的体积用V表示。也就是说，每个充气基质的床体积。V=Vt/g一般亲水性基质的膨胀率大于疏水性。11分配系数和移动速率分配系数(K):表示固定相和流动相含量的比率，通常用K表示。移动系数：是在同一时间内固定上移动的距离与流动上移动的距离之比，通常用Rf表示。如果k值大，则表明牙齿组的固定和结合力大，移动率小。相反，结合力小，移动率大。不同物质的分配系数和移动率不同。几种茄子物质之间的分配系数或迁移率差异越大，分离效果越好。2，基本原理，吸附层分析法中使用的固定相基质是颗粒性吸附剂。吸附剂的表面有很多随机分布的吸附点。吸

5、附部位通过范德发力(中性分子徐璐非常接近时产生的微弱电磁重力)和静电重力生物分子结合蛋白质和核酸等。其结合力的大小与各种生物分子结构和吸附剂的性质有着密切的关系。例如，将包含不同结构的A、B两种茄子物质的混合溶液添加到包含吸附剂的层分析柱中(参见图3-2)。然后注入适当的洗涤剂，调节速度，使其低速。a，B利用两种物质的吸附剂结合力的差异可以将两者分开。如果吸附剂对A的结合力小于B，则B保持在柱上，而A移动到柱下。可以说，A，B 2物质从柱上分离是因为A，B 2物质在固定相(吸附剂)和流动相(洗涤剂)之间的分配系数(即固定相上的物质浓度除以流动相上的浓度)不同。如果A物质分配系数小于B物质，则A

6、在柱中的移动速度大于B。因此，单层柱上混合物的分离过程，本质上是吸附、取消吸附、再吸附的连续过程，或者是固定相和流动相之间连续分布的过程。3，吸附剂，1吸附剂的选择要具有表面积大，颗粒均匀，吸附选择性好，稳定性强，成本低等性能。选择具体吸附剂时，主要根据吸附剂本身和吸附材料的理化性质进行。一般来说，极性强的吸附剂容易吸附极性强的物质，非极性吸附剂容易吸附非极性物质。但是为了便于吸附，对极性大的分离物，必须选择极性小的吸附剂。否则。为了选择理想吸附剂，需要经过多次实验才能获得。2吸附剂的性质下面简述了羟基磷灰石和硅胶吸附剂的性质，(1)羟基磷灰石(HA)由于HA的吸附容量高，稳定性好(t85，p

7、H5.5-10.0中均提供)，因此准备和精制蛋白质、酶、核酸、病毒及其他生命物质HA的磷酸基团和生物分子表面的正电荷基团的相互反应只起到次要作用。(2)硅胶(silica gel)特性A含水量中含有大量硅组(-Si-OH)的颗粒极性吸附剂。它对氨基酸衍生物、类固醇激素、皂苷类、脂肪、色素等物质具有结合力(吸附作用)。吸附：要分离的物质的结构差异；更重要的是，与自身含水量有密切的关系。水分含量高，结合力小(或活性小)。如果硅胶表面的玻璃含水量大于17，则结合力很小，此时只能用作分布层的固定相。B粒度现在使用精细的Lichroprepsi 60Merck公司产品4063pm (200400目)硅胶

8、吸附剂分离植物样品的很多有效成分，效果很好。粒度细，吸附部位多，分布均匀，分离效果好。但是流速缓慢，分离时间长。是提高工作压力(1bar)加速流速、缩短细粒子硅胶柱分离取样时间的快速分层分析装置。(见图3-3)设备部件：玻璃柱：长度(715厘米)，直径(310厘米)，底部有活塞。滴漏漏斗(溶剂存储瓶)气体循环部件等。先将干硅胶或湿硅胶吸附剂(固定床)装入玻璃柱。那个表面铺了一层石英砂。然后加入样品溶液，在上面放置滴漏漏斗，倒入洗涤剂。可以控制气体循环部件上的连接侵蚀阀等部件，从而控制气体流速。最终使样品能在15min内洗涤和分离。设备部件：玻璃柱：长度(715cm)，直径(310cm)，底部有

9、活塞。滴漏漏斗(溶剂存储瓶)气体循环部件等。激活市面上的硅胶或处理过的硅胶，激活110烤箱安装(约1h)。激活的硅胶必须立即使用。如果当时没有使用的话，应该保存在烘干机或密封的瓶子里，但是时间太长了，渡边杏。活性测定为了使分离物质的重复性好，每次使用的硅胶活性必须一致。活性测定习惯用6茄子染料进行。1偶氮苯；2对甲氧基偶氮苯；3苏丹黄色；4苏丹红；5对氨基偶氮苯；六对羟基偶氮苯。硅胶活性测定具体操作，原理：在吸附柱上，吸附剂吸附6茄子染料的能力不同，冲洗后位置不同，可以测定吸附剂的活性等级。具体工作是将上述6茄子染料分别溶解在l0ml苯溶剂中，稀释50ml石油醚，然后将20ml溶液放入1.5c

10、ml0cm的硅胶柱中，放入20ml苯和石油醚(1: 4)的混合液冲洗，根据各种染料的位置按照表3进行洗涤。活动水平低的活性大，结合力强。表3-4硅胶活性水平的标准化规范，活性水平低的活性大，结合力强。第四，在吸附色谱中使用洗脱剂的洗脱剂是液体。也是溶解一般吸附的样品，平衡固定相的溶剂。适当的洗脱剂必须符合以下条件：纯度高。稳定性好，可以彻底清洗分离的成分。粘度小，容易与所需成分分离。洗涤剂的选择：根据分离物中各成分的极性、溶解度、吸附剂的活性进行选择。一般蛋白质或核酸吸附在极性强的羟基磷灰石后，应使用含有盐梯度的缓冲液冲洗。相反，甾体或色素等化合物可以通过极性弱的硅胶吸附用有机溶剂洗涤。应通过

11、实验确定所用洗涤剂的梯度浓度大小及极性强弱选择。5，层分析柱的制备和层分析工作，柱层分析设备主要为：层分析柱部分收集器磁搅拌器恒流泵检测器图3-4，一层分析柱的绝对多数层分析柱是下端细长且有筛板的玻璃管。支柱直径与长度的比率通常为1: 101: 40。使用非常细的粒子吸附剂安装支柱时，最好使用比例较大的层分析柱。相反，最好使用比例较小的楼层分析柱。这有助于节省时间和提高分辨率。2吸附剂的使用量取决于其工作容量和分离物中各成分的性质。工作容量高，吸附剂用量低。一般吸附剂的使用量是分离样品的30-50倍。样品中各成分性质相似，难以分离时，吸附剂用量应增加，有时大于100倍。在安装3根柱之前，必须先

12、将楼层分析柱垂直固定在支架上。安装柱后，分层柱的基质应遵循以下标准：均匀、绷紧、无气泡长柱的方法分干法和湿浆法两种。干燥法直接将吸附剂添加到柱上，然后反向溶剂，就不容易排出气泡。(威廉莎士比亚，哈姆雷特，溶剂，溶剂，溶剂，溶剂，溶剂，溶剂，溶剂，溶剂)湿法系统首先将适量的溶剂放入柱内，排出空气，然后将预先用溶剂浸泡的吸附剂均匀搅拌(见图3-5)，牙齿悬浮液在柱高1413吸附剂表面应平整，并始终浸泡在溶剂中，防止产生气泡。后一种支柱安装法适用于各种气质。安装的层分析柱应立即与洗涤剂连接，在约50厘米的高工作压力下调整流速(见第5章)，将柱体积的洗涤剂流向固定床，使其保持平衡，固定高度恒定或离子强

13、度与洗涤剂一致。当四相型和洗脱平衡液流向与固定相表面相同的位置时，应在固定相表面轻轻添加用滴管分离样品的溶液，尽量避免冲动气质。样品液的液面流入固定床表面时，用滴管放入洗涤剂(体积从固定床表面的高度约5厘米)，与柱顶上装有洗涤剂的水液瓶连接，开始冲洗(见图3-6)。同时，与柱底部的部分收集器连接，立即进行等级收集(按体积或时间收集)。接着收集的各宽容液为浓度或活性测定，5。可以绘制出溶出曲线，根据测量结果绘制出溶出曲线(以横坐标表示管弧或溶出体积，以纵坐标表示各容液中样品的浓度或活性)。理想洗脱曲线如图3-7所示。图中的A峰和B峰都是对称的，两峰不重叠表明样品液的组分完全分离。分层棒的面积(E

14、FG)、最高价(BE)、半封高的宽度(HI)等参数是定性定量洗衣的基础。6吸附剂的再生吸附剂经适当处理后恢复性能的过程称为吸附剂的再生。一般来说，不同的吸附剂(或基质)有不同的再生方法。详细操作请参阅各章的气质处理方法及相关文献。6，应用和实例1应用(1)纯化生命物质使用吸附剂的柱层分析或批吸附法(见实例1)纯化生命物质。使用羟基磷灰石吸附剂，可以分离酸性、中性和碱性蛋白质，徐璐分离其他结构的核酸(见图3-8)。用牙齿吸附剂分离含有其他磷酸基团的蛋白质和脂质等化合物也很有效。(2)分离蛋白质的婴儿一般蛋白质，是通过十二烷基硫酸钠(SDS)或三乙醚(Triton X-100)等洗涤剂处理后，产生

15、分子质量不同的蛋白质体系。牙齿物质可以用吸附柱层分析法分离(见图3-9)。(3)浓溶液部分稀溶液经分层柱处理后，浓度可以大大提高。例如，Tiselius在200毫升的稀牛血清白蛋白(BSA)溶液中收集HA层分析柱，只有几毫升，浓度提高了几十倍。2例用HA层柱对胞质型多角体病毒双链RNA 90g胞质B型多角体病毒(CPV)双链RNA混合样品2g枯草杆菌(Bacillus subtilis)3H-双链DNA 2g高醋酸菌14C-双链DNA中5毫米直径的分层分析柱(各管收集液可根据紫外分光光度计和液体闪光测量仪的测量分析得出的数据绘制分离示意图(见图3-10)。如图所示，双链RNA首先在低磷酸盐缓冲

16、液中清洗，双链DNA后来清洗。2节薄层层理层层理层层理层层理层层理层层理层层理层层理层层理(TLC):将玻璃板或涤纶等载体上的涂层基质固定为固定相，将液体流动的层理分析方法。其基本原理和柱层分析，纸层分析比较相似。牙齿层分析方法是将吸附剂等物质涂在载体上，形成薄层，然后根据纸层分析操作展开层。薄层可根据固定相种类分为：吸附薄层层析法(固定相：吸附剂)分配薄层色谱(固定相：牙齿支撑剂中固定的水溶液或有机溶剂)离子交换薄层色谱(固定相3360离子交换剂)等分层吸附、薄层色谱、离子交换薄层一层短，薄层分离混合物一般为15-60min；只要。2设备简单，操作方便，适用于分析和准备。3温度变化和溶剂饱和度对Rf值(迁移率)影响不大。4可使用腐蚀性显色剂(将淀粉用作粘合剂和葡萄糖凝胶固定床的薄板除外)。5灵敏度高。主要用于识别小分子物质和准备少量样品。各种展示层