病毒感染力的滴定.ppt

1、第3章病毒传染性滴定，半致死剂量LD50(50%致死剂量)，半感染剂量EID50(鸡蛋50%感染剂量)，半感染剂量tcid50(组织培养物50%感染剂量)，斑块形成单位(PFU)，确定病毒传染性的方法： 1。测定TCID50病毒的操作步骤：在青霉素瓶中从10-1-10-10连续稀释病毒10次。将稀释的病毒接种到96孔微孔板中，每个稀释孔8个，每个孔100升。向每个孔中加入100升细胞悬液，使细胞数量达到3105个细胞/毫升。设置正常单元格控件，正常单元格控件为两个纵向行。每天观察和记录结果通常需要5-7天。结果根据里德-明希法或卡伯法、TCID50计算法、里德-明希法计算(如果每个孔中加入50

2、微升病毒稀释液)。病毒溶液中无CPE积累的CPE孔数、稀释后的CPE孔数、无CPE孔的CPE孔数占10-18 027 0100(27/27)10-28 019 0100(19/19)10-37 111 191.6(11/12)10-43 54 640 10)10-517113 0.7(1/14) 距离比(百分比高于50% -50%)/(百分比高于50% -低于Lgdcid 50=稀释度的对数与此例中高于50%病变率的稀释度的对数之间的差值=0.8(-1)(-3)=-3.8 tdcid 50=10-3 . 80 . 1ml，Karber法，Lgdcid 50=l-d(s-0.5)l :最高稀释度

3、的对数d:稀释度对数之间的差值s:正孔的总和原理：将生长成单层的敏感细胞接种适当稀释的病毒悬液后，在覆盖的固体或半固体介质(琼脂糖、甲基纤维素)的作用下，病毒只能感染和破坏邻近细胞，经过几个增殖周期，形成肉眼可见的局部病变细胞区，即局部病变。程序、操作步骤，将平板或6孔板中的敏感细胞培养到单层培养液中，并加入含有钙和镁的PBS(pH7.4)洗涤1-2次。用维持液将病毒溶液连续稀释10倍，用适当稀释的病毒悬液接种培养孔中的单层细胞，接种量约为原始培养液的1/10-1/5，以覆盖单层细胞，每次稀释接种2-3个孔。将培养板置于37.5% CO2培养箱中吸附1小时，弃去病毒溶液，用含钙和镁的PBS(p

4、H7.4)洗涤3次。取1.6%-2%的低熔点琼脂糖，将其熔化，冷却至38-42，与预热至38-42的含6%-10%小牛血清的无酚红DMEM混合，注入细胞培养板。将其放在室温下直到琼脂糖凝固，或者将其放在冰箱4中几分钟直到琼脂糖凝固，然后在37.5% CO2培养箱中继续培养。每天在显微镜下观察细胞病变。斑块出现后(2-3天)，用含钙和镁的PBS将0.1%中性红储备溶液稀释10倍，然后滴在细胞培养板上。在37.5% CO2培养箱中处理1小时后，将染液吸走，并在培养箱中继续培养2-3小时。TK-突变体与野生型病毒形成的斑块比较，如果测定PFU，则直接记录病毒经一定稀释后形成的斑块数，然后根据公式计算

5、PFU。在病毒纯化的情况下，在200升的维持溶液中挑选出斑块，冷冻并解冻三次，接种在24孔细胞培养板上，其中PK-15细胞已经生长成单层，然后在37.5% CO2培养箱中培养，直到损伤完全发生。常规病毒种子纯化：收集患病细胞悬液，测量TCID50值，然后选择TCID50值较高的细胞进行几轮空斑纯化，获得高滴度的病毒，经扩大培养后可作为种子使用。筛选重组病毒：收集患病细胞或病毒悬液，通过聚合酶链反应或其他方法进行鉴定，并将阳性细胞用于下一轮菌斑纯化。因此，经过3-5轮噬斑纯化后，可以获得纯化的病毒颗粒。菌斑技术的应用：用于病毒纯化：选择病毒克隆以确定病毒悬浮液中感染病毒的含量，菌斑形成单位，PFU)，概念：每毫升病毒悬浮液中的菌斑数，即病毒悬浮液中感染病毒的浓度。计算方法：如果用每孔0.4毫升的PRV接种PK-15细