脑星形细胞肿瘤中Survivin基因的表达及其病理意义

1、脑星形细胞肿瘤中Survivin基因的表达及其病理意义 研究生 曹晓蕾 导 师 陈 莉,脑星形细胞肿瘤是中枢神经系统中最为常见的一类肿瘤，约占颅内肿瘤的30%，可发生于各个年龄期，尤以30-40岁为高峰发病年龄1。由于脑星形细胞肿瘤无论分化高低均呈浸润性生长，因此多数病人远期疗效较差，即使经过标准治疗（手术+放疗+全身化疗）后，仍难以达到根治。一般认为其中位生存期不足1年2,是一类严重危害人类健康的疾病。,对肿瘤发生发展的机制研究中越来越多的证据显示细胞凋亡异常与细胞恶性增殖和分化受阻一样，在大多数恶性肿瘤的发病学上起重要作用，涉及到细胞凋亡信号途径的所有方面。其中，研究最深入、广泛的是凋亡抑

2、制基因和凋亡活化基因的异常。,凋亡蛋白抑制因子家族（inhibitor of apoptosis proteins ，IAPs）新成员Survivin可抑制多种凋亡刺激因子引起的凋亡，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin mRNA在大多数正常组织中无表达3 ,广泛表达于人类各种肿瘤组织。其独特的结构，选择性的细胞内分布的特点，具有明显细胞周期性，只在G2/M期表达，自1997年被发现以来，Survivin与肿瘤的关系已成为研究热点。,肿瘤的生长、局部浸润及转移依赖血管形成，因此，肿瘤组织内的微血管形态、分布、数量等对肿瘤的生长、治疗和预后至关重要。星形细胞肿瘤分化程度较低时，肿瘤常

3、有出血、坏死。因而对星形细胞肿瘤中血管生成的研究更为重要。CD34作为一种公认的血管内皮标记物，可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究，因此可通过CD34的单克隆抗体标记星形细胞肿瘤中的微血管（MV），在镜下（1020倍）计算MVD,以探究星形细胞肿瘤中血管形成的规律。,本实验将应用免疫组化和RT-PCR的方法检测70例脑星形细胞肿瘤中Survivin的表达，同时结合临床随访资料，探讨Survivin表达与脑星形细胞肿瘤的临床因素、肿瘤病理分级、MVD以及预后之间的关系。,一、材料与方法,标本 人脑星形细胞肿瘤标本70例，分别由南通医学院病理教研室、南通医学院附属医院病理科、常州市第一人民医院病理

4、科提供，为1996-2002年常规外检的病理蜡块。其中男48例，女22例，年龄20-77岁，平均年龄49.3岁。根据世界卫生组织的年龄分期标准以44岁为界，将本文病例分为青年组（44岁）和中老年组（44岁）两组。,标本均经过常规病理组织学检查，双盲法根据瘤细胞多形性、核分裂、肿瘤中出血坏死、肿瘤血管形成等按照WHO标准进行分级：级10例，级26例，级34例。其中26例标本同时有新鲜肿瘤组织保存于70低温冰箱（级3例，级7例，级16例）。另取1例源于交通事故脑外伤手术患者的100mg脑新鲜组织、5例非正常死亡的人脑组织蜡块分别作为正常对照组，由南通医学院附属医院脑外科及南通医学院法医教研室提供。

5、,主要试剂,2.RT-PCR试剂 RT-PCR试剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司，包括Trizol、 RT试剂盒、PCR试剂盒、Survivin引物合成、-actin引物合成。DL2000 DNA Marker购于 TaKaRa公司。,1.免疫组化试剂 兔抗人Survivin多克隆抗体（RAB-0536）、鼠抗人CD34单克隆抗体（MAB-0034）、超敏SP（鼠/兔）试剂盒（KIT-9710）、DAB显色试剂盒（DAB-0031）均为即用型，购自福建迈新生物技术有限公司。,方法 1.RT-PCR检测Survivin基因的表达 组织中总RNA的提取 取保存于-70冰箱中的人脑星形细胞肿

6、瘤组织、正常人脑组织各约50-100mg（相当于1到2粒米粒大小），置于1.5ml玻璃匀浆器中，加入1mlTrizol充分匀浆。 将匀浆液转至1.5ml灭菌EP管中，室温静置5分钟。 加入0.2ml氯仿，震荡15秒，静置2分钟。 4离心，12000g15分钟，取上清（100l枪轻轻吸）。 加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟。 4离心，12000g15分钟，弃上清。,加入1ml75%酒精，轻轻洗涤沉淀，4离心，7500g5分钟，弃上清。 晾干，根据提取的RNA量加入适量的DEPC水溶解（65促溶15分钟）。 使用蛋白核酸定量仪定量：实际RNA浓度（mg/ml）=测得的RN

7、A浓度50/1000。 RNA变性胶电泳，电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察条带，判断组织中的RNA是否降解。, cDNA第一链的合成（20ul体系） 按以下次序将各成分加入一0.5mlEP管中 5RT buffer 4.0ul dNTP Mix（10mM） 2.0ul Oligo(dT)18Primer(0.5ug/ ul) 1.0ul 逆转录酶 1.0ul 酶抑制剂 0.5ul DEPC水 9.5ul 模板链RNA 2ul 总体积 20ul 42，1小时，70，10分钟。,PCR操作步骤（20ul反应体系） 按下列次序将各成分加入一0.5ml的离心管中 10PCR Buffer 2.0ul

8、Mg2+ 1.5ul dNTP mix（2mM） 2.0ul Survivin特异性primer（10pmol/ul） 2.0ul cDNA模板 2.0ul 双蒸水 8.1ul TaqDNA聚合酶 0.4ul,94，3分钟 94，45秒（变性） 37次 501分钟 721分钟 72，5min 4保存 （褪火） （延伸） （总延伸） 于第8个循环72、35秒时按暂停，加入2ul-actin特异性引物。,-actin目的基因产物为495 bps， 其序列：上游5AAGTACTCCGTGTGGATCGG3 下游5ATGCTATCACCTCCCCTGTG3,Survivin目的基因产物为377bps，

9、 其序列：上游5TATCTGCCAGACGCTTCCTA3 下游5ATGACCTCCAGAGGTTTCCA3,PCR产物的检测和分析 取PCR产物5ul + 6lodding 1ul混匀后加样,进行1%琼脂糖凝胶电泳，同时加4ulDL2000 DNA Marker 作为PCR产物长度对照。电压100V, 30分后将胶板置于紫外灯下观察，Survivin和-actin产物条带分别位于377bps和 495bps处。PCR产物条带的密度测定采用四星凝胶图像分析系统进行，以Survivin带亮度(Ls)、-actin带亮度(L)分别与背景亮度(Lb)的差值之比表示该Survivin的相对表达量,用公

10、式表示为: Survivin的相对表达量=(Ls-Lb)/(L- Lb)。,2.免疫组化染色SP法 Survivin、CD34均需柠檬酸缓冲液高温修复。 免疫组化结果判断 肿瘤实质细胞中Survivin阳性反应定位于细胞质呈棕黄色。参照Kawaski4等采用半定量积分法判断结果: 阳性细胞数5%为0分，6%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，75%为4分； 阳性强度淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。 两积分相乘，0分为阴性（-），1-4分为弱阳性（），5-8分为中等阳性（），9-12分为强阳性（）。,CD34：肿瘤间质血管内皮细胞标记物,阳性部位位于内皮细胞胞膜和

11、胞浆。以CD34标记MV，MV呈棕黄色。 MVD观察与计数：以与周围肿瘤细胞和结缔组织成分明显区别的任何一个棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇作为一个血管，只要结构不相连，其分枝结构也作为一个血管计数（管腔结构及内含红细胞并非计数所必须）。先在显微镜低倍视野（410倍）下选定高MVD处,再在高MVD5个高倍视野（2010倍）下，计数MVD，取其平均值作为该标本的MVD。,病例随访情况 对30例有确切地址的2000年底前进行手术的星形细胞肿瘤患者术后进行随访，随访至2003年12月止，结果随访到26例，失访4例，随访率为86.67%（26/30）。随访结果显示星形细胞肿瘤患者术后生存时间为0-40个月

12、不等。,统计学处理 两样本均数比较用t检验； 多组数值变量资料间比较用单因素方差分析； 率的比较用2检验 ； 等级资料的比较采用秩和检验,两样本比较采用Wilcoxon法，多个样本比较采用Kruskal-Wallis法,多个样本两两比较采用t检验； 对随访资料的分析采用Kaplan-Meier法,两组生存率的比较用Wilcoxon-Gehan检验，多组生存率的比较用log-rank检验。 检验水准0.05。,二、结果,RT-PCR检测Survivin基因mRNA的表达 1.总RNA的提取与检测 随机取3例进行变性胶电泳检测RNA的质量，结果见图1，28S、18S条带清晰可见，5S条带很弱，且2

13、8S条带亮度远远大于18S条带，说明提取的总RNA完整，没有降解。三条泳道条带亮度基本一致，说明RNA上样量基本相同。,图1 .RNA变性胶电泳,2.RT-PCR检测Survivin基因的表达与肿瘤临床病理因素的关系 RT-PCR检测Survivin基因的表达 Survivin基因的RT-PCR产物为377个碱基， -actin的RT-PCR产物为495个碱基。 26例脑星形细胞肿瘤中Survivin基因的表达见图2、3。,495bps 377bps,495bps 377bps,图2、3，M：DL2000 DNA Marker ；N：正常脑组织；1-26为星形细胞肿瘤,由图2、3显示，本组脑星

14、形细胞 肿瘤中Survivin基因的阳性检出率 为65%（17/26），正常脑组织中 未检测到Survivin的表达。,Survivin基因表达与脑星形细胞肿瘤临床病理 特征的关系,不同性别的患者，Survivin基因表达的阳性率分别为：男性70%（14/20），女性50%（3/6），不同性别间Survivin基因表达无显著差异（P0.05）。,不同年龄的患者，Survivin基因表达的阳性率分别为：44岁66.67%（12/18），44岁62.5%（5/8），不同年龄组间Survivin基因的表达无显著差异（P0.05）。,不同病理分级的脑星形细胞肿瘤，Survivin基因表达的阳性率分别为

15、：级66.67%（2/3），级85.71%（6/7），级56.25%（9/16），各病理级别间Survivin基因的表达无显著差异（P0.05）。,3.Survivin基因相对表达量与脑星形细胞肿瘤临床病理因素的关系 根据公式Survivin基因的相对表达量=(Ls-Lb)/(L- Lb) 分别计算出各例的Survivin基因相对表达量，进一步 分析，本组有17例脑星形细胞肿瘤表达Survivin基因， Survivin基因相对表达均量为1.080.17。,Survivin基因相对表达量与脑星形细胞肿瘤病理分级的关系 病理分级 例数 Survivin相对表达量 P值 2 0.8550.007

16、6 1.020.08 P=0.0233 9 1.1710.175 在脑星形细胞肿瘤的不同病理级别间Survivin基因相对 表达量存在显著差异（P0.05）， 两两比较显示，Survivin基因相对表达量在级与级 间（P=0.039）存在显著差异，而在级与级间 （P=0.384）、级与级间（P=0.163）无显著差异。,免疫组化染色结果 1.Survivin蛋白在脑星形细胞肿瘤中的表达 2.脑星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与 MVD的关系 3.脑星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与 术后生存时间的关系,Survivin阳性染色均定位于肿瘤细胞的胞浆中， 棕黄色颗粒状(见照片1、2、

17、3)，阳性细胞呈弥漫或 局灶分布。 本组病例Survivin蛋白阳性表达率为57.14%（40/70）， 其中（+）为12例，（+）为19例，（+）为9例。 5例相对正常脑组织中Survivin表达阴性。,Survivin阳性染色定位于肿瘤细胞的胞浆中， 呈棕黄色颗粒状（免疫组化SP法500）,Survivin强阳性染色，肿瘤细胞的胞浆中可见 棕黄色颗粒（免疫组化SP法500）,Survivin强阳性染色，肿瘤细胞的胞浆中可见 棕黄色颗粒（免疫组化SP法500）,不同病理分级、年龄、性别中Survivin蛋白的表达率 级阳性率为10%（1/10），级阳性率为53.85%（14/26），级阳性率

18、为73.53%（25/34）。 青年组阳性率为45%（18/40），中老年组阳性率为73.33%（22/30）。 男性阳性率为60.42%（29/48），女性阳性率为50%（11/22）。 不同年龄组间、不同性别间Survivin表达无显著差异（分别进行Wilcoxon两样本比较法，均P0.05）。,Survivin蛋白在脑星形细胞肿瘤中的表达率,脑星形细胞肿瘤中不同病理分级间Survivin蛋白表达的比较 Survivin蛋白在脑星形细胞肿瘤中的表达 病理分级 例数 Survivin表达强度 H（u） P值 10 9 1 0 0 26 12 4 6 4 10.43 P0.05 34 9 7

19、13 5 不同级别的脑星形细胞肿瘤间，Survivin的表达有显著差别（Kruskal-Wallis法，P0.05）； 两两比较的秩和检验（t检验法）显示，脑星形细胞肿瘤级与级(t=2.45，P0.05)，级与级(t=3.45，P0.05)Survivin表达存在显著差异，而级与级间（t=1.27，P0.05）Survivin表达无显著差异。,CD34阳性反应物为棕黄色颗粒，分布在血管内皮 细胞胞膜和胞浆(见照片4、5、6)。以CD34标记MV， MV呈棕黄色，并计算MVD。,CD34在脑星形细胞肿瘤中的表达（免疫组化SP法150）,CD34在脑星形细胞肿瘤中的表达（免疫组化SP法250）,C

20、D34在脑星形细胞肿瘤中的表达（免疫组化SP法500）,脑星形细胞肿瘤中MVD与Survivin蛋白表达强度的关系 脑星形细胞肿瘤中MVD与Survivin蛋白表达强度的关系 Survivin表达强度 例数 微血管密度（MVD） P值 12 14.424.92 19 18.743.30 P=0.0000 9 25.314.81 (F=17.50) MVD在Survivin不同表达强度间存在显著差别(P0.05), Survivin（+）与Survivin（+）间（P=0.028）， Survivin（+）与Survivin（+）间(P=0.000)， Survivin（+）与Survivin（

21、+）间(P=0.002)均存在显著差异 经Spearman等级相关分析显示，Survivin表达强度与MVD呈显著 正相关（rs=0.6682，P0.05）。,本组病例有术后随访结果26例，术后存活时间为0-40个月不等。 Survivin表达（）组随访到12例，术后平均生存时间为179.8个月； Survivin表达阳性组术后平均生存时间为6.66.5个月，其中Survivin表达（+）组随访到4例，术后平均生存时间14.55.3个月， Survivin表达（+）组随访到5例，术后平均生存时间5.24.0个月， Survivin表达（+）组随访到5例，术后平均生存时间为1.61.8个月。,脑

22、星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与术后生存时间的关系 Group1：Survivin(-)；Group2：Survivin(+)； Group3：Survivin(+)；Group4：Survivin(+),经Log-rank时序检验，Survivin不同表达强度之间的生存率有显著差别（=24.55，P0.05）。 进一步两两比较，Survivin表达（）组的生存率高于Survivin表达（+）组（P=0.0052）及Survivin表达（+）组（P=0.0018）； Survivin表达（+）组的生存率高于Survivin表达（+）组（P=0.0143）及Survivin表达（+）组（

23、P=0.0139）； Survivin表达（）组与Survivin表达（+）组的生存率无显著差异（P=0.7611），Survivin表达（+）组与Survivin表达（+）组的生存率无显著差异（P=0.1693）。,分别统计级、级、级脑星形细胞肿瘤中Survivin阳性者与阴性者的术后生存时间。 级阳性者无随访资料，阴性者有1例随访资料，术后生存时间为24个月； 级随访到14例，阳性者为7例，术后平均生存时间为9.76.6个月，阴性者为7例，术后平均生存时间为18.110.2个月； 级随访到11例，阳性者为7例，术后平均生存时间为3.44.9个月，阴性者为4例，术后平均生存时间为13.210

24、.3个月。,级星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与术后生存时间的关系 Group1：Survivin(-)；Group2：Survivin(+),级星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与术后生存时间的关系 Group1：Survivin(-)；Group2：Survivin(+),经Wilcoxon-Gehan检验显示， 级中阴性者的生存率高于阳性者（P=0.0472）， 级中阴性者的生存率也高于阳性者（P=0.0462）。,RT-PCR与免疫组化检测Survivin表达结果的比较 1.比较26例同时进行RT-PCR和免疫组化检测Survivin结果 RT-PCR和免疫组化检测结果的比较

25、 免疫组化检测 RT-PCR检测 合计 + + 13 3 16 4 6 10 合计 17 9 26 进行配对检验,P=1.000，提示两种检测方法无显著差异。 进一步做相关分析，rn=0.4218，提示两种方法呈正相关。,2.比较17例免疫组化Survivin不同表达强度与RT-PCR结果为阳性Survivin相对表达量的关系 Survivin基因相对表达量与免疫组化表达强度间的关系 免疫组化表达强度 例数 Survivin基因相对表达量 P值 4 0.910.09 + 3 1.020.07 P=0.0003 + 6 1.060.12 （F=13.44） + 4 1.320.06,单因素方差分

26、析显示，Survivin基因相对表达量在免疫组化不同表达强度间存在显著差异（P0.05），两两比较显示，Survivin基因相对表达量在免疫组化表达为（-）、（+）、（+）分别与（+）间（分别P=0.000、P=0.009、P=0.008）存在显著差异，而其他各组间Survivin 相对表达量无显著差异（P=0.547、P=0.164、P=0.940）。,经Spearman等级相关分析（rs=0.7468，P=0.0034）提示Survivin基因在免疫组化表达强度与由RT-PCR检测的该基因的相对表达量间存在正等级相关关系，即随着Survivin基因相对表达量的增高，免疫组化表达强度也相应的

27、增强。,三、分析与讨论,凋亡蛋白抑制因子家族（IAPs，inhibitor of apoptosis proteins）是抑制细胞凋亡的重要成分，该家族抑制细胞凋亡的作用远远大于bcl-2家族的作用5。 Survivin是1997年由耶鲁大学的Ambrosini等首先发现3的一种新的IAP家族成员。该基因定位于人染色体17q25.3区，基因全长15kb，由4个外显子和3个内含子组成，编码含有142个氨基酸，分子量为16.5kd属于胞浆蛋白。,作为最强的凋亡抑制因子之一，Survivin主要通过以下方式，直接或间接抑制caspase活性而发挥抗凋亡作用：Survivin粘附于活化的caspase

28、-3或caspase-7； Survivin直接结合caspase9; Survivin封闭辅助性线粒体源性caspase激活因子（SMAC）保护IAPs家族成员免受其抑制； Survivin增强IAPs家族其他成员功能，对抗SMAC的作用。 Survivin还能在细胞有丝分裂前期通过与纺锤体微管发生特异性结合反应，间接抑制caspase对纺锤体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞器的完整性，使细胞逃避细胞周期G2 /M期检测点（checkpoint）的监控，抵抗因DNA损伤或突变自身诱导的细胞凋亡，从而导致细胞异常分裂增殖 。,Survivin还参与细胞增殖、分裂和细胞周期的调控。研究显示，S

29、urvivin是调控细胞G2/M期的基因，它与周期素依赖蛋白激酶Cdk4相互作用启动了细胞周期，导致大量细胞无限制增殖8。 Survivin的过表达，造成细胞增殖增加，凋亡减少，打破了两者间的平衡，导致肿瘤的发生。,Survivin在血管形成过程中发挥了重要作用 Oconnor DS9等用血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导静止期的内皮细胞分裂，发现血管内皮细胞Survivin表达量升高了16倍，提示Survivin可能是血管形成中生长因子诱导的保护性基因。 Tran运用反义核苷酸阻断Survivin的表达后发现，由VEGF介导的血管形成被明显抑制，提示Surv

30、ivin抑制凋亡可能不仅局限对肿瘤细胞，对血管内皮细胞可能也存在着通过VEGF的介导进而抑制内皮细胞凋亡的作用10。 肿瘤血管生成在肿瘤发生、发展过程中至关重要，而Survivin对内皮细胞凋亡的抑制在肿瘤血管形成中发挥了关键作用，因此拮抗Survivin有望成为抗肿瘤治疗的重要靶点。,Survivin基因只表达于恶性肿瘤组织中，而在正常分化的成人组织中除胸腺和胎盘组织微弱表达外，其余组织无表达。 本研究结果指出，无论是应用RT-PCR对新鲜组织中Survivin基因表达的研究还是应用免疫组化对固定保留组织中Survivin表达的研究，结果均显示Survivin只表达于脑星形细胞肿瘤，而在正常

31、脑组织中均无表达，说明Survivin表达是脑星形细胞肿瘤的特异性分子事件，该结果与文献报道一致。,本文应用免疫组化和RT-PCR法检测长期固定的石蜡组织中或是手术后70保存的新鲜组织中Survivin的表达，结果显示，脑星形细胞肿瘤中Survivin基因在新鲜组织的RT-PCR中的阳性检出率为65%；应用免疫组化检测Survivin蛋白的阳性表达率为57.14%。该比例稍高于同类研究，国内周逸鸣等用免疫组化ABC法检测脑星形细胞肿瘤中Survivin检出率为37.9%13。 本组检测阳性率偏高的原因可能是本组样本中高级别的脑星形细胞肿瘤较多，或本组使用的迈新公司的Survivin抗体（即用型

32、试剂）及SP试剂均较为敏感。,本实验中RT-PCR的研究结果显示， Survivin基因的相对表达量在恶性程度高的级脑星形细胞肿瘤中显著高于级（P0.05），而与患者的年龄、性别无明显关系。 免疫组化结果显示，随着肿瘤级别的提高，Survivin阳性率也逐步上升，在级脑星形细胞肿瘤中Survivin表达的阳性率与表达强度均较低，在、级脑星形细胞肿瘤中Survivin表达的阳性率与表达强度增加，显著高于级，但高级别、级之间无显著差异。该结果与国外的同类研究相符14、15。,星形细胞肿瘤中表达Survivin的细胞常为生长旺盛的肿瘤细胞，阳性表达的细胞核大，核膜增厚，常染色质为主，常伴核仁，这些获

33、得抗凋亡能力的肿瘤细胞获得了永生性（immortality），可造成肿瘤细胞增殖。肿瘤细胞增殖，又使Survivin过度表达，Survivin与肿瘤细胞增殖互为因果。有研究表明，70%的星形细胞肿瘤会向恶性程度高的方向转化，Survivin表达阳性细胞对凋亡的进一步抵抗可能是这种转变中的重要一环。,免疫组化实验结果显示，Survivin表达阳性的同一标本中，并非所有的肿瘤细胞均呈阳性染色，而同一级别的不同标本，阳性染色的细胞数也有差异。 这一现象可能与Survivin表达的细胞周期特异性有关。由于Survivin只在G2/M期表达，而同一肿瘤组织内的肿瘤细胞处于不同的细胞周期，因此只有处于G2

34、/M期的肿瘤细胞才可呈现阳性反应，那些处于G1/S期的肿瘤细胞则呈阴性反应。而同一级别的不同标本中，癌细胞总体动力周期不同，因此Survivin阳性染色的细胞数有差别。 除此以外，肿瘤细胞本身的异质性也决定了并非所有细胞均同步同样表达Survivin。 由于存在一些Survivin表达阴性的肿瘤，故推测，除了Survivin调控肿瘤凋亡抑制外，尚有其他因素调节肿瘤细胞的抗凋亡，尚有其他因素维持着肿瘤细胞的增生与永生化。,本研究以CD34标记血管内皮细胞来计算MVD，结果显示MVD在Survivin不同表达强度间存在显著差别，随着Survivin表达强度的增强，MVD相应增高，Survivin表

35、达强度与MVD呈高度正相关。 该结果提示，Survivin与星形细胞肿瘤的血管形成可能存在密切关系，Survivin的高表达会增加肿瘤血管的形成，使肿瘤级别增加，因此，高级别星形细胞肿瘤常表现为高血管性，这些新生的血管可为肿瘤的生长提供营养，也可为肿瘤细胞侵袭进入循环系统提供良好的机会，从而促进肿瘤的恶性进展。,有报道指出，在结肠癌、乳腺癌、神经母细胞瘤等恶性肿瘤检测Survivin mRNA或蛋白质表达对预测预后有一定的价值16-19。 本实验中，术后随访到26例，随访率为86.67%（26/30）。免疫组化结果显示，Survivin表达阳性者其术后存活时间显著低于Survivin表达阴性者

36、，而且在相同级别的级和级星形细胞肿瘤中，Survivin阳性者术后存活期同样短于阴性者。说明这些患者在常规进行化疗中，Survivin阳性表达细胞可能直接产生对化疗抵抗，使其术后疗效不佳，生存期较短。正如在对肺癌细胞的体外培养时发现，Survivin阳性的细胞株比阴性者具有更强的抵抗化疗的能力20。本组研究结果提示Survivin的高表达预示着星形细胞肿瘤患者预后不良。Survivin可成为一个有价值的评估星形细胞肿瘤预后的指标之一。,本实验分别采用了RT-PCR和免疫组化两种方法对Survivin的表达进行研究。对所获得的实验结果进行比较，显示两种方法间在检测Survivin表达率的差异无显

37、著性，并且高度相关。 逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR），该方法检测的灵敏性较高21，使组织中微量表达的基因通过扩增使其被定量分析成为可能，比较免疫组化方法阳性检出率高了近10个百分点。但该方法需要新鲜组织，在新鲜组织保存中RNA极易降解，使该方法应用于临床受到了限制。,用免疫组化技术在石蜡组织切片中检测Survivin基因表达，可以在肿瘤组织原位观察Survivin表达的定位及反应强度，较客观地反映了星形细胞肿瘤中Survivin蛋白表达，并可以直接与形态学改变进行比较分析。因免疫组化可用于石蜡

38、切片中，所以可用于回顾性分析，亦不需要特殊设备来贮存组织，更方便于临床研究。 本文将RT-PCR及免疫组化这两种技术结合在一起进行研究，可将两者的优势互补，从而对Survivin在脑星形细胞肿瘤中的表达有一个较全面的了解。,尽管RT-PCR和免疫组化检测Survivin表达的结果有高度的相关性，但用两种方法所检测的Survivin表达其意义有所不同。RT-PCR检测的Survivin表达主要是存在于组织中经转录加工后的Survivin mRNA，而免疫组化法检测出的是表达于细胞浆中存在的Survivin特异性抗原（即经Survivin mRNA转录、翻译的特异蛋白质）。RT-PCR检测率高于免疫组化，是因为免疫组化检测的蛋白质在Survivin mRNA进一步翻译过程中的降解或由于翻译水平的调控发生了异常，导致该mRNA未被翻译。,本实验中，26例同时使用RT-PCR及免疫组化的标本，有3例免疫组化呈阳性反应，而RT-PCR结果为阴性，而且这3例免疫组化正是弱阳性灶性表达，是