RT-PCR课件.ppt

1、一、定义,二、逆转录,逆转录 (reverse transcription) 以RNA为模板，合成与其互补的DNA的过程。 逆转录酶 (依赖RNA的DNA聚合酶) 1. RNA指导的DNA聚合酶活性 2. RNA水解酶活性 3. DNA指导的DNA聚合酶活性,过 程,试管内逆转录反应,First strand cDNA synthesis反应体系的基本成分,模板:组织或培养细胞RNA。 引物:oligo dT, random primer等。 逆转录酶：AMV: 禽类成髓细胞性白血病病毒 M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒 RNA酶抑制剂 底物：等浓度的四种dNTP 反应环境:缓冲液（RT buf

2、fer）,随机引物法是三种方法中特异性最低的 引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20l反应体系。 Oligo(dT)比随机引物特异性高 它同大多数真核细胞mRNA 3端的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20l反应体系使用0.5g oligo(dT)。o

3、ligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。,First strand cDNA synthesis反应的条件,加入模板，引物，dNTP，DEPC-H2O （冰上） 65，5min（变性）；冰上放置 加入10XRT buffer，RNasin，RT， DEPC-H2O 42/50(根据所购试剂盒酶的性质），60min（延伸） 85处理5m，立即放置到冰上 （酶失活） 加入1l的RNaseH，37处理20m（降解RNA） 取出2-5l进行PCR试验/分装，-20保存,按试剂盒说明进行,三、聚合酶链式反应-PCR,一种将微量的目的D

4、NA片段在体外快速、大量 扩增的技术。 以目的DNA（待扩增DNA）分子为模板，以一 对分别与模板3末端互补的寡核苷酸片段为引物， 在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着 模板链延伸直至完成2条新DNA链的合成。不断重复 这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。,PCR 试管内模拟细胞内DNA半保留复制,PCR 反应体系的基本成分,模板DNA:基因组DNA、cDNA等 特异引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚 dNTP片段，一般18-30,上下游引物 0.2-0.5 mol/L，设计原则？ DNA聚合酶:具耐热性、如Taq酶 0.5-5U/100l 底物: 等浓度的四种核苷酸（dNT

5、P） 20-200 mol/L 反应环境:含有Mg2的Tris-Cl缓冲液。,PCR 反应的条件,预变性： 94，2-10min 变性：94, 30s, 模板DNA变性成为单链 退火：Tm-5,30s，引物与模板DNA结合 延伸：72，DNA聚合酶催化DNA合成 时间与待扩增片段长度有关， 1Kb,延长时间 重复25-30cycle. 最终延伸： 72， 10min。,RT-PCR应用,获得目的基因（编码蛋白） RNA定性及半定量分析,组1：control 组2：药物处理后,实验内容RT-PCR扩增小鼠肝组织-actin基因,RNA质量的高低影响实验的成败。 RNA完整性：RNA酶（RNase

6、）是导致RNA降解最主要的物质。此酶广泛存在，且非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。因此，RNA提取时最需要注意的是RNA酶的失活处理。 防止DNA/蛋白质的污染,一、RNA的提取,处理方法,RNase广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套。 RNase 的又一污染源是移液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。 玻璃和金属物品250 烘烤3小时以上。 枪头、Ep管等塑料制品 RNase-free的枪

7、头与Ep管（贵） 处理：DEPC-H2O浸泡,在玻璃容器中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05% - 0.1%（DEPC-H2O），37过夜。（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用） 将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37 或室温下处理过夜。 将装有DEPC-H2O处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。 将DEPC-H2O高压处理。,TRIzol 是一种新型总 RNA 抽提试剂， TRIzol的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质

8、解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 8羟基喹啉，与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制 异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质， 并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速 与核酸分离。 -巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。,抽提方法：TRIzol,实验步骤,取100mg小鼠肝组织，加入0.5 ml TRIzol试剂，用匀浆器打匀 (Trizol 预先放于冰上，充分打匀)，转移至ep管中。 2. 加入 0.5ml TRIzol 冲洗匀浆器，转移

9、至Ep管中，吹打混匀10次，室温放置5 min。 3. 加入200 l 氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温静置3 min。 4. 12000rpm，4 离心15 min。 将上清液小心转移到新的1.5 ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置10min。（注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。） 12000rpm， 4 离心10 min 。,7. 小心弃去上清液，防止RNA沉淀丢失。 用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入 1ml 乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。（RNA于70%乙 醇中非常稳定，-20可存1年） 9. 7500rpm，室温离心10min。 10

10、. 尽可能彻底地弃去上清，防止RNA沉淀丢失。 真空离心干燥35分钟，或放在室温下使乙醇完全 挥发掉（不可过干）。 12. 沉淀用20 l DEPC-H2O溶解，如发现沉淀难溶， 60 处理10 min。 13. 测定RNA浓度与纯度(A260/A280)，分装，-70保 存，短期使用。,注意事项,TRIzol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，操作时注意。 操作过程中RNase污染的主要来源是手和空气中的浮沉，注意配带手套，迅速操作，管盖盖严；点酒精灯。 细胞裂解必需充分。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质 裂解细胞时最好在低温下操作

11、，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。 吸取上清时，宁少勿滥（防止DNA/蛋白质污染）。,二、逆转录-PCR,两步法 RT与PCR分开进行 各自在最优化的条件下进行 两步法通常是取第一步反应 产物的1/10进行第二步反 应，使得其灵敏度不如一步法 高。 多个基因的RT-PCR,一步法 RT与PCR同时进行 RT 和PCR 都不能在最佳条件 下进行并且容易相互干扰 简便操作、减少污染的可能性 由于得到的全部cDNA产物都一 起经PCR扩增，使得一步法的灵 敏度更高,一步法反应体系Tiangen KR113,10RT-PCR Buffer 2.5l dNTP Mix （10mM each） 1l 5RT-PCR enhancer 5l Hotmaster Taq酶 1.25l Quant RTase 0.25l actin上游引物（10mol/L） 1.5l actin下游引物（10mol/L） 1.5l 模板RNA 2l DEPC-H2O 10l,总体积 25l,操作步骤,1. 按上述体系加入各成分，每管体积25l。 注意：若需要进行多个RT-PCR反应，可将各组分加倍混 匀后再分装到每个反应管中，可以减少实验操作 产生的误差，