环境毒理学常用实验方法

1、环境毒理学常用实验方法、急性毒性实验积累性毒性实验亚慢性和慢性毒性实验突变试验畸形试验致癌试验、毒理学实验基础、实验动物(laboratory animal )是人工培育、控制其携带微生物、遗传背景明确、来源清晰、可用于科学研究的动物。 温血动物(恒温动物)兔、豚鼠、大鼠、小鼠有时候选择猴、狗、猫等实验动物，有时候选择狗、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、实验动物，种类选择个体有时候选择年龄、体重、性别、生理状态的健康状态，有时候容易得到，有时候容易饲养实验动物的选择使用现有的毒理学研究资料，观察气体、蒸汽对粘膜的刺激作用猫毒物对皮肤的局部作用豚鼠或兔(皮肤对刺激物质的反应类似于人)过敏性反应豚鼠(易致

2、敏)的呕吐作用的实验研究犬， 猫的外界环境因素是生物体温过高体温过低的反应兔或猫(大鼠，小鼠体温调节不稳定)高血压病理犬，大鼠(容易引起血压变化)物质的致癌作用小鼠和大鼠慢性中毒实质上损害脏器的毒物小鼠(实质脏器容易发生病变)，个体选择，年龄特别性别应根据目的，动物性别没有特别要求，应选雌雄各半。 生理状态妊娠哺乳通常的实验，为了某个特定的实验目的而排除的处于特殊生理状态的动物不应该使用。 用于健康状态的动物进入实验室后，在实验开始前观察1周以上，排除不健康的动物，使实验动物适应环境。 实验动物的选择、常用染毒途径和方式；(1)口服给药、给药、吞咽胶囊；(2)经气道动物的自吸收(静态吸入染毒、

3、动态吸入染毒)人工动物的气管注入；(3)经皮肤；(4)直接注入其他途径注射途径胃内，不接触口腔和食道所给化学物的量是正确的。 喂食是将化学物质溶解在无害溶液中混入饲料和饮用水中，让动物自己摄取含有化学物质的饲料和水，从每天吃的饲料和水推测动物实际摄取的化学物质的量。 常用的染毒途径和方式，(1)口服染毒的优点：接触化学物的方式符合人类接触污染食品和水的方式，方法简便，操作方便。 缺点吃饭时浪费，损失饲料多，摄取量不正确的化学物质有异味的话，动物有可能拒绝摄取。化学物质在室温下能挥发的情况，饲料中和水能水解的情况下，给药量也不正确的呼吸器和皮肤交叉吸收的可能性更适合进行多日染毒，急性毒性试验一般

4、(1)经口染毒吞咽胶囊将必要量的受试者化学物质放入药用胶囊中，强制吞咽到动物的舌后咽。 该方法剂量准确，特别适用于易挥发、易水解、有异味的化学物质。 兔子、猫、狗等大动物可以用这个方法。 常用的染毒途径和方式，(2)通过气道染毒的所有气体或易挥发的液体化学物质都可以通过气道吸入，在生产过程中形成气溶胶传播的化学物质也可以通过气道吸入。 类型：动物将自吸收静式吸入染毒动式吸入染毒人工动物气管注入人工动物气管注入液状或固体外来化学物质注入肺内。 这是一个手术过程，仅适用于化学物质制备肺损伤模型，不适用于一般毒性研究。常用染毒途径和方式、静态吸入染毒在一定容积的染毒罐内放入一定量的试验对象，引起含有

5、一定浓度试验对象的空气环境，使试验对象在规定时间内吸入达到染毒，适合短时间的染毒试验。 动式吸入染毒以机械通风为动力，不断将含有已知浓度的受试者的新鲜空气送入染毒罐内，排出等量的污染气体，使染毒浓度相对稳定，使染毒时间不受染毒罐(室)容积的限制，避免动物缺氧、CO2蓄积、温度增加等对试验结果的影响可长期应用的常用染毒途径和方式、(3)皮肤染毒液状、气态和粉尘状外源化学物均有接触皮肤的机会。 皮肤可吸收的化学物质主要是以扩散方式通过皮肤角质层的屏障，表皮角质细胞的间质中充满了非极性的脂质物质。 脂溶性化学物质主要通过这种途径渗透到皮肤，角质层薄的皮肤部位更容易吸收。 常用染毒途径和方式，实验前仔

6、细检查取毛部位皮肤是否有伤、红肿、皮疹等异常现象，清除不合格动物。 染毒时投用必要毒剂的容量由单位体重决定。 接触时间必须与人实际接触这种物质的时间相同。常用染毒途径和方式、成年动物老龄动物表皮厚度、细胞成分变化，保证不同皮肤部位形成的化学物质渗透率差异，一般大鼠、豚鼠、兔均使用背部皮肤。 面积由所选动物及受试者的剂量和剂型决定。 (例如，家兔取5cm6cm的直径面积，豚鼠取3cm4cm的直径面积，大鼠取1.5cm2.0cm的直径面积。 (3)通过皮肤染毒；(4)通过其他途径染毒时，需要对外来化学物质进行绝对毒性或比较毒性研究，或者进行必要的特殊研究(如静脉注射毒物动力学、代谢研究、急救药物筛

7、选等)，往往通过注射途径染毒静脉注射：大鼠，小鼠尾静脉，兔耳缘静脉注射路径肌肉注射：小动物，常用染毒路径和方式，动物实验的一般操作方法，急性毒性试验，一、急性毒性概念，急性毒性是指生物(人或实验动物)的一次或24h以内的一次：瞬间染毒，如经口染毒在注射途径中染毒，但在经气道和经皮肤上染毒，在某一特定期间内持续接触化学物质的过程，“一次”含有时间要素。 多次：当外源化学物毒性过低，或一次染毒量受生物容量限制，需给实验动物大剂量时，可分为24h以内染毒。 二、以急性毒性试验为目的探讨化学物的致死量，初步评价该化学物对人类毒性的危险性，求出该化学物的剂量反应关系，为其他毒性实验选择染毒剂量奠定基础。

8、 显示急性毒性的大小： LD50，急性毒性试验，三，急性毒性试验的内容(1)急性毒性测定经过确定一次染毒的LD50或LC50 (2)皮肤染毒实验，考察被检化学物质能否经皮肤进入体内，LD50 (3)局部作用实验将被检化学物质直接用于皮肤及眼结膜、急性毒性试验、三、急性毒性试验的内容(4)中毒症状的观察根据染毒动物的症状和身体特征，大致了解毒物作用的程度和可能的作用部位。 (5)功能及病理组织学检查选择必要的功能指标，求出毒作用剂量与功能变化的关系，确定急性阈值剂量。 经病理组织学检查，进一步改善解毒作用部位及毒程度。 急性毒性试验，四，哺乳动物急性毒性试验(一)半数致死量(LD50，LC50

9、)的测定1 .动物准备一般采用小动物，如小鼠、大鼠、豚鼠等。实验动物应事先观察7天左右，了解健康状态和正常活动状态。 本实验按随机分组原则分组，一般分为56个实验组(根据需要准备对照组)，每组510只动物(小鼠多10只)。 急性毒性试验，四，哺乳动物的急性毒性试验(一)半数致死量(LD50，LC50 )的测定2 .给药量是先调查与文献中的被试验者的相似物LD50或LC50，用3倍差的3个给药量组进行预试验，对各组3只动物，求出动物的全活、全死给药量的预试验急性毒性试验，四，哺乳动物的急性毒性试验(一)半数致死量(LD50，LC50 )的测定3 .药液制备和染毒给药的剂型溶解性水溶液、悬浮液、油

10、剂或乳剂，在非吸入染毒试验中，每单位体重给药等容量的药液的方法很多，可能对实验用液的制备有新的溶剂、新的帮助急性毒性试验、四、哺乳动物急性毒性试验(一)半数致死量(LD50，LC50 )的测定4 .症状应观察记录染毒开始后实验动物的中毒表现、生理状况变化和死亡情况。 观察时间可以是数小时、数日、1周或2周，但通常为2周以内(2周以内)。急性毒性试验、急性毒性试验、四、哺乳动物急性毒性试验(一)半数致死量(LD50，LC50 )的测定5 .病理学检查观察器官有无血、出血、水肿等变化，对有变化的器官进行病理组织学检查。 生存动物也应在观察期届满后进行病理学检查。 6 .结果评估计算半致死量或浓度：

11、确定绝对致死量或浓度、最小致死量或浓度和最大容量或浓度。 急性毒性评价：与同系物和其他毒物对比，毒性分级与对比分析。 急性毒性试验，四、哺乳动物急性毒性试验(二)急性阈值剂量的测定急性阈值剂量是指毒物一次染毒后对机体不良影响的最小剂量，是用于评价毒物非致死性损害的残奥计。 急性毒性试验，四、哺乳动物急性毒性试验(二)急性阈值剂量的测定1 .观察指标的选择应根据毒物和实验动物的特性采用不同的生理、生化及形态学指标。 (1)对于新的化学物质，首先选择整体状态和非特异的作用指标，如活动能力、应激状态、条件反射等。 (2)对于毒作用特征较明显的毒物，该毒物作用可选择引起最敏感反应的指标，如有机磷农药选

12、择胆碱酯酶活性的变化。 (3)刺激性气体和蒸汽可以测定其刺激阈值浓度或嗅觉阈值浓度。 急性毒性试验，四，哺乳动物急性毒性试验(二)急性阈值剂量的测定2 .实验方法(一)游泳试验主要通过观察动物的活动能力，明确不同剂量的毒物对生物体力的影响程度，是研究阈值剂量(或浓度)的常用指标。 实验动物一般使用老鼠和大鼠。 记录各动物从进入水中到口鼻下水的5秒钟时间，即游泳时间。 在游泳中记录游泳速度、运动姿势等。 染毒组与对照组游泳时间、速度及游泳姿势的差异比较评价。 急性毒性试验，四，哺乳动物急性毒性试验(二)急性阈值量的测定2 .实验方法(二)阈值试验刺激性气体和蒸汽刺激，对上呼吸道、眼、口腔等器官黏

13、膜产生局部刺激作用，观察毒物在不同浓度引起的刺激症状，发现毒物刺激症状引起的最低浓度，即阈值观察指标除一般刺激症状如眼泪、鼻涕等外，主要观察动物唾液出现的时间和严重程度。将50以上的动物“嘴唇周围流着少量的唾液”以上程度的刺激症状的最小浓度作为阈值浓度。 急性毒性试验，四、哺乳动物急性毒性试验(三)局部作用试验用于研究一些化学物质引起接触的皮肤和粘膜的症状，如炎症和烧伤。 1 .急性皮肤刺激腐蚀试验化学物质对哺乳动物皮肤是否有刺激或腐蚀作用。 我选择了白色豚鼠和兔子作为实验动物。 观察涂抹部位的皮肤反应，全面评价刺激作用。 急性毒性试验，四，哺乳动物的急性毒性试验(三)局部作用试验2 .急性眼

14、刺激/腐蚀试验结膜囊染毒试验。 在实验中多使用兔子和豚鼠作为实验动物。 将受试者的化学物质0.1mL滴入一只眼结膜囊内，用手捂住眼睑，闭眼数秒，另一只眼滴入生理盐水进行对照。 记录滴药后1h、12h、24h、48h、72h和96h的局部反应，如充血、水肿、泪、光、角膜、结膜和眼球障碍的程度和恢复时间等。 为了在规定间隔时间观察刺激或腐蚀作用的程度，同时全面且完全地评价刺激作用而进一步记述。 急性毒性试验，五、水生动物毒性试验部分水生生物对水质变化敏感，反应明显。 因此，在环境毒性实验中常用水生生物作为实验动物，特别是在制定污水排放标准时多进行水生生物的急性毒性实验。 鱼类、甲壳动物、藻类毒性试

15、验等方法。 急性毒性试验、鱼类毒性试验1 .实验用鱼的选择应具有一定的区域代表性，易于在实验条件下饲养，对化学物质敏感。 短期试验多采用我国青、草、鲣鱼、鳗鱼4大养殖淡水鱼，一般体长7cm。 比较长期的试验多采用金鱼，一般在3cm以下，体长最长不得超过最小体长的1.5倍。 选用行为活跃、体色光泽、鳍完全伸长、逆水性强、食欲好的健康鱼，在实验室内观察1周使用。 急性毒性试验、鱼类毒性试验2 .实验条件试验容器采用玻璃缸或白搪瓷桶，其盛水量以每条鱼23L水为佳。 水的pH为6.78.5，冷水温度为1218，温水温度为2028，水温变化为2。 水中溶解氧不能在4 mg/L以上，可以放置干净的河水、湖

16、水或者3d以上的自来水。 急性毒性试验、鱼类毒性试验3 .半数耐容浓度的测定半数耐容浓度或半数生存浓度的测定试验设施修订与哺乳动物的LD50测定大致相同。 通过初步试验确定100致死浓度和不引起死亡的最大浓度，在其浓度范围内以l(0.65-0.9 )的等比级数确定57浓度组，再追加空白对照组，各组1020尾鱼，染毒48-96h。 染毒起始头8h常见，以后可定期观察24h、48h、72h、96h，记录中毒反应和死亡时间。 死鱼立即取出剖面检查。 试验期间水环境(DO、pH、水温)稳定。 根据LD50的计算方法，根据24h、48h、96h各组的鱼的死亡数，求出相应时间的TLm。急性毒性试验、鱼急性毒性试验设置修订、有机磷农药乐果对鱼的急性毒性试验设置修订、六、发光细菌急性毒性试验的基本原理：发光细菌在干净水体中发光一定，受污染物影响发光受到抑制，抑制的程度与水体中毒物的总浓度和毒性大小有关急性毒性试验、梨形四膜虫毒性试验药物、有机物、无机物和水污染物毒理学评价蚯蚓急性毒性试验进行土壤环境毒理学试验标准动物两栖动物毒性试验两栖动物对水体污染物的敏感性高于其他动物的鸟类、鸟类急性毒性试验食物链、化学品安全性评价、急性毒性试验， 积累毒性试验积累毒性试验，积累毒性作用