细菌的基因重组.ppt

1、第五节 细菌的基因转移和重组,凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（gene recombination）或遗传重组（genetic recombination），简称重组。,作用： 重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。,重组与杂交的关系： 重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交 而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。 杂交中必然包含着重组， 而重组则不限于杂交这一形式。 真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexual hybridi

2、zation）等及原核生物中的转化、转导、接合和原 生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。,微生物中各种形式基因重组的比较,基因重组的意义,基因重组是杂交育种的理论基础。 杂交育种的优点： 由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。,基因重组的意义,杂交育种的缺点： 由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来

3、培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了70年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。,原核生物的基因重组,原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。,特点： 片段性，仅一小段DNA序列参与重组； 单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单方向转移； 转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。,（一）接合（conjugation，mating）,供体菌（“雄性”）通过性毛与受体菌（“雌性”）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞

4、，就是接合子（conjugant）。,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 细菌的多重营养缺陷型杂交实验,通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！,U型管实验,存在范围： 细菌：G 较为多见如E. coli(大肠杆菌)、Salmonella(沙门氏菌)、Shigella(志贺氏菌)、Serratia(粘质沙雷菌)、Vibrio(弧菌属) 、Azotobacter(固氮菌) 、Klebsiella(克雷白氏杆菌属)和Pseudomonas(假单胞菌属)等最为常见 放线菌：S

5、treptomyces(链霉菌属) 、Nocardia(诺卡氏菌属) 接合还可发生在不同属的菌种之间，如E. coli与Salmonella typhimurium之间或S. typhimurium与Shigella dysenteriae之间,大肠杆菌的接合机制,接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导,F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性毛（sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。,含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性毛,不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性毛,F因子为附加体质粒 可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色

6、体上,F因子的四种细胞形式,a）F-菌株， 不含F因子，没有性毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；,b）F+菌株， F因子独立存在，细胞表面有性毛。,c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性毛。,d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。 细胞表面同样有性毛。,接合的一般过程,接合时F+细胞与F 细胞相遇，性菌毛与F 细胞表面发生吸附而形成接合管； F+细胞内，F因子的一条DNA单链在特定的位点上发生断裂； 断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，通过模板的滚动，一方

7、面把解开的单链以5为先导通过性菌毛推入F 细胞中，另一方面，在供体细胞内以滚动的环状模板重新合成一条互补的环状单链，以取代传递到F 细胞中的那条单链。这种DNA复制机制称为滚环模型（rolling circle model）； 在F 细胞中，以外来的供体DNA线状单链为模板合成一条互补单链，并随之恢复成环状双链F因子。 至此，原来的F 菌株变成了F+ 菌株。原来的供体仍为F+ 菌株。,（二）转导（transduction）,通过病毒（defective phage）的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体

8、细胞，就称转导子（transductant）。,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式： 一个细胞的DNA 通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中,能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体。,细菌转导的二种类型：,普遍性转导,局限性转导,流产普遍转导,完全普遍转导,1.普遍转导（generalized transduction）,通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍转导。,一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。,（1）完全普遍转导,简称普遍转导或完全转导（complete transdu

9、ction）。经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外源DNA在其内进行交换、整合和复制，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，称作普遍转导子，这种现象就称普遍转导。,Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌） 的野生菌株,Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌） 的营养缺陷型突变株,P22嗜菌体,供体菌,受体菌,转导模型,供体菌,受体菌,转导媒介噬菌体,误包,转导颗粒,普遍转导子,双交换,同源配对,10-610-8,过程： （1）P22在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（10 6 10 8）噬菌体的衣壳将

10、与噬菌体头部核心大小相似的一段供体DNA片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身DNA的缺陷噬菌体。 （2）供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源DNA片段导入受体细胞内。 （3）在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。,S.typhimurium的P22噬菌体、 E.coli的P1噬菌体、 Bacillus

11、 subtilis的PBS1和SP10等噬菌体 都能进行完全普遍转导。,供体菌 转导媒介噬菌体 受体菌,（2）流产普遍转导,简称流产转导（abortive transduction）。经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。,受体菌,外源DNA,细胞分裂,外源基因经转录、转译而形成的少量酶,获得外源DNA,获得少量酶,不断稀释,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA， 而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。,普遍性转导的三种

12、后果：,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子。,流产转导（abortive transduction）,转导DNA不能进行重组和复制，但其 携带的基因可经过转录而得到表达。,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,外源DNA被降解，转导失败。,DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA， 而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。,2.局限转导（specialized transduction， restricted transduction）,指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。 最初于

13、1954年在E. coliK12中发现。,特点： 只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因，一般为噬菌体整合位点两侧的基因； 该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带； 缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过程中，发生低频率（10-5）“误切”（不正常切离，abnormal excesion）或由于双重溶源菌的裂解而形成； 局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的诱导并引起裂解后才产生。,局限转导,低频转导,高频转导,根据转导子出现频率的高低分类,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上 宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正

14、常切割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。 但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。,E. coli的嗜菌体和80嗜菌体具有局限转导的能力。,普遍性转导和局限性转导的比较,受体菌（recipient cell，receptor）直接吸收供体菌（donor cell）的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。,通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子（transformant）

15、。,（三）转化（transformation） 1. 定义,原核生物 Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）、 Haemophilus（嗜血杆菌属）、 Bacillus（芽孢杆菌属）、 Neisseria（奈瑟氏球菌属）、 Rhizobium（根瘤菌属）、 Staphylococcus（葡萄球菌属）、 Pseudomonas（假单胞菌属）、 Xanthomonas（黄单胞菌属）等。,2. 转化微生物的种类,真核微生物 Saccharomy cescerevisiae（酿酒酵母）、 Neu-rosporacrassa（粗糙脉孢菌）、 Aspergillusniger（黑曲

16、霉）等。,受体细胞要处于感受态. 感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态 供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1 107 D 左右 菌株间的亲缘关系密切,3、转化发生的条件,感受态（competence）,感受态是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。,研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。,感受态细胞（competent cell）具有摄取外源DNA能力的细胞。,自然感受态 是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；,人工感受态 则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将

17、DNA导入细胞内。 （该过程与细菌自身的遗传控制无关！）,感受态,感受态受遗传控制，但也存在个体差异。 感受态出现的时间不同； 出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期 Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期， Bacillus（芽胞杆菌属）的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。,感受态,感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同. Bacillus subtilis不超过1015% Streptococcus pneumonia和Haemophilus influe

18、nzae（流感嗜血杆菌）达到100% 感受态由细胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影响：cAMP、Ca2+等最明显。如用CaCl2 处理E. coli可以诱发其产生感受态。 转化DNA的最低浓度：在群体中含有15%感受态细胞时，0.1gDNA/ml细胞悬液即可有效发生转化,调节感受态的一类特异蛋白称感受态因子。,膜相关DNA结合蛋白（membrane-associated DNA binding protein）,细胞壁自溶素（autolysin）,几个核酸酶,转化因子（transforming principle）,转化因子的本质是离体的DNA片段。一般只有15kb左右。,在不同的微生物中

19、，转化因子的形式不同。 良好的转化因子有dsDNA（最宜于细胞表面结合）、ssDNA和质粒DNA，通常不能与核染色体组发生重组。,转化的频率通常为0.11.0，最高为20。能发生转化的最低DNA浓度极低，为化学方法无法测出的1105mgmL（即11011gmL ）。,自然遗传转化（natural genetic transformation）,人工转化（artificial transformation）,4、转化的类型,根据感受态建立的方式，可以分为：,5. 转化过程,（1）自然遗传转化（简称自然转化）,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoni

20、ae）的转化现象，转化过程研究得较深入的就是这种G细菌。,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力,进行自然转化，需要二方面必要的条件：,建立了感受态的受体细胞,外源游离DNA分子,转化的过程,以S. Pneumonia strr（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段： 吸附：双链DNA片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。在吸附过程的前阶段，如外界加入DNA酶，就会减少转化子的产生。稍后，DNA酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞； 切割：在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106的DNA片段；

21、 入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5105的DNA片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；,转化的过程,重组：来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取代，于是形成了一个杂合DNA区段（heterozygous region）。在这一过程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与； 复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另

22、一个未获供体基因； 转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。,枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）,strR，存在抗链霉素的基因标记,strS，有链霉素敏感型基因标记,自然转化过程的特点：,a）对核酸酶敏感；,c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）供体菌和受体菌之间的亲源关系；,d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；,b）不需要活的DNA给体细胞；,提高质粒的自然转化效率的二种方法： 1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高； 2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或

23、将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌重组获救。,（2）人工转化,用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,质粒的转化效率高；,可转化的形状,荚膜多糖的合成 专一性酶的合成 专一性蛋白质的合成 抗药性,（四）原生质体融合（protoplast fusion）,通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定的重组子的过程，称为原生质体融合。由此法获得的重组子，成为融合子（fu