传染病病原诊断技术精品课件

1、传染病病原体的诊断技术,Friend or Foe?,Rotavirus,Ebola virus,Bacterium,Algae,Protozoan,Virus,1973年以来部分新发的传染病,1973 轮状病毒 婴儿腹泻的主要病因 1975 细小病毒B19 5号病，慢性溶血性贫血的再障危象 1976 隐孢子虫 隐孢子虫病，急性小肠结肠炎 1977 埃博拉病毒 埃博拉出血热 1977 嗜肺军团菌 军团病 1977 汉坦病毒 肾综合征出血热 1977 空肠弯曲杆菌 空肠弯曲菌肠炎 1977 丁型肝炎病毒 丁型肝炎 1980 嗜人T细胞病毒I型 T细胞淋巴瘤白血病 1981 金黄色葡萄球菌产毒株

2、中毒性休克综合征 1982 大肠埃希菌O157：H7 出血性结肠炎 1982 嗜人T细胞病毒11型 毛细胞白血病 1982 伯氏疏螺旋体 莱姆病 1983 人类免疫缺陷病毒 艾滋病(HIV),1973年以来部分新发的传染病(续),1983 幽门螺杆菌 消化性溃疡病 1986 环孢子球虫 环型孢子虫病(顽固性腹泻) 1988 人疱疹病毒6型 突发性玫瑰疹 1989 丙型肝炎病毒 丙型肝炎 1990 戊型肝炎病毒 戊型肝炎 1992 0139霍乱弧菌 O139霍乱 1992 巴尔道氏体 猫抓病，杆菌性血管瘤病 1993 汉坦病毒分离株 汉坦病毒肺综合征 1994 Sabia病毒 巴西出血热 199

3、4 新变异型克雅氏病(人类疯牛病) 1985年疯牛病（牛海绵状脑炎BSE） -1994年出现首例nvCJD-1996年提出nvCJD概念 病原为朊蛋白PrP（英） 1995 庚型肝炎病毒 庚型肝炎 1997 H5N1禽流感病毒 人禽流感 1998 Nipah病毒 尼巴病毒性脑炎 1999 西尼罗病毒 西尼罗病毒性脑炎 2000 裂谷热(Rift Valley)病毒 裂谷热 2003 SARS冠状病毒 SARS（传染性非典型肺炎）,大部分人类致命性疾病均是由动物传播，包括现正肆虐全球的禽流感。 每年至少有一种新病原体，包括病毒、细菌、寄生虫、原生动物和真菌等从动物传染给人类。 前所未有的速度产生

4、突变，并传给人类，就如艾滋病、马尔堡出血热、SARS以及现正肆虐全球的禽流感等难抗病毒。 研究人员分辨1407种令人类生病的病原体，发现其中至少800种越过种物界线，由动物传至人类。,新发传染病动物传播,与人类行为及环境的改变有关,过去25年来曾出现38种新病原体袭击人类，其中四分三为源自动物的疾病，包括艾滋病、马尔堡出血热、SARS及禽流感等。 丛林打猎、密集耕种、全球变暖及长途旅行的普及，增加疾病跨种物传播的机会，使动物身体上的病原体容易产生突变，感染人类。 一个典型例子是艾滋病毒，最初原是在非洲猿猴身上发现的一种病毒，其后传播至人类身上，更演变成世纪绝症。,新病原体的特征,现时人类新传染

5、病的病原体，多属于核糖核酸(RNA)病毒类，包括艾滋病毒及流感病毒，可于短时间内发生突变，并容易适应新宿主，令跨种物传播机会变得更大。,人类与传染病较量中的四方面重大突破,隔离检疫制度的建立; 病原微生物的发现; 特效药物的出现; 疫苗的诞生 .,快速诊断是关键,在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和预防是三个关键环节。其中，及时正确诊断最为关键，是有效治疗的基础，也是制定预防策略的依据。 及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预警，这是现代传染病防治体系的最前沿 对已知传染病要尽快明确诊断 对未知新发传染病要查病因,传染病的实验室诊断,一般检查; 生化检查; 病原学检查; 免疫学检查; 病理组织检

6、查; 影像学检查.,传统的和常规的病原学诊断,分离培养(细胞,组织动物); 显微镜检查(光学和电子显微镜); 抗原成分检测(ELISA,免疫荧光等); 分子生物学基因诊断(核酸杂交,PCR等);,Electronmicrographs,Adenovirus,Rotavirus,(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.),免疫荧光检测,Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC),(Virology Laboratory,

7、 Yale-New Haven Hospital),细胞病变效应 (cpe),Some viruses kill the cells in which they replicate, often easily visible as cpe, other viruses produce little or no cpe Typically rounding or detaching of cells and cell fusion (syncytia),From Principles of Virology , Flint et al ASM press,From Principles of V

8、irology , Flint et al ASM press,实 验 动 物,Laboratory animals - animal models of human infection. Historically the only way to study viruses was from animal to animal. Problems - 1) inconvenient and expensive, 2) not a defined system - leads to generation of virus mutants, 3) animal welfare issues, Adv

9、antages - 1) some viruses can only be studied in this way, 2) gives unique insight into virus pathogenesis Embryonated eggs,From Principles of Virology , Flint et al ASM press,核酸诊断的发展史,核酸分子杂交 聚合酶链反应（PCR） 核酸定量分析,核酸的直接检测 核酸扩增检测(PCR) 定性PCR 定量PCR,核酸分子杂交(nucleic acid molecula hybridization),genome,probe,

10、32P 35S 3H 125I 生物素 地高辛 酶,genome,genome,genome,probe,probe,probe,检测方法：放射自显影 底物显色 化学发光,常用核酸分子杂交技术,斑点杂交（spot blot hybridization) 凝胶电泳印迹转移杂交（Southern blot hybridization) 原位杂交（in-situ hybridization),聚合酶链反应（PCR）,基本步骤和原理,变性（高温）,退火（低温）,延伸（适温）,每一循环,模 板,引物,引物,dATP dGTP dTTP dCTP Taq酶,PCR原理和步骤,定量PCR-荧光实时定量PCR

11、,Taqman水解探针法 杂交双探针法 分子信标（环性探针）法 Amplisensor能量转换法等,新发传染病的病原体？,病原学发现的“科赫三定律”,一、每种传染病必定能发现其病原体； 二、能培养出该病原体的纯种； 三、以培养出的纯种病原体接种于动物可以产生相同的病变。,建立该病原体的鉴定方法,动物试验 临床实验室诊断 流行病学研究等,分离到该病原体,确定一种疾病病原体的基本步骤,最终确定病原体与疾病的病因学关系,基本思路,回答两个问题： 是否是已知的病原体或其变种？ 是否是完全未知的一种病原体？ 基本要求：快、准,已知病原体的快速诊断,高通量的检测技术,高通量的病原体筛选技术,病原体核酸的高

12、通量检测 技术一：多重PCR（联用技术：质谱技术、 液相芯片技术） 技术二：病原体基因芯片 病原体抗原或抗体的高通量检测 核心技术：蛋白质芯片,Multiplex PCR-Mass Tag system,多重 PCR-质谱联用技术,美国哥伦比亚大学Lipkin 研究组发明了一种基于multiplex PCR-MassTag（多重PCR与质谱联用）的高通量病原体快速筛选技术。 优点：由于使用光敏感的分子量标签，增强了multiplex PCR引物设计的适应性和灵活性，使检测通量有大幅度的提高。应用质谱分析PCR产物上的分子量标签克服了凝胶电泳分辨率的局限或荧光染料种类的局限。,1. PCR am

13、plification with conjugated primers 90 minutes,2. PCR purification on filter plate 30 minutes,3. Elution into 96-well loading plate for mass spectrometer analysis,96-well thermocycler plate,B,A,4. Automated sample injection, photocleavage and detection 1:30 minutes/sample,Purified samples,Ultraviole

14、t Light,Cleavage of mass tags from amplicon,MS,B,A,B,A,B,A,B,A,B,A,B,A,Ionization and detection,A,B,5. Identification of pathogen by signal analysis,PCR-Mass Tag system,NUCLEIC ACID CONJUGATED MASS TAGS,Photocleavable linker and spacer,MS sensitivity enhancer,Variable mass unit,DETECTION OF 58 DIFFE

15、RENT MASS TAGS BY APCI-MS,目前，建立在此技术上的有呼吸道病原体检测模块（包括19个病毒和3种细菌），流感病毒亚型检测模块，出血热病原体检测模块，痘疹病毒检测模块和脑炎脑膜炎病原体检测模块。尽管目前已开发的分子量标签只有64个，但根据质谱分析的分子量范围，还可有极大的拓展空间，保证了这一技术具有足够的发展前景和潜力。,应 用,RESPIRATORY SYNDROME PANEL,Influenza A Matrix Influenza A N1 Influenza A N2 Influenza A H1 Influenza A H2 Influenza A H3 Inf

16、luenza A H5 Influenza B HA RSV Group A RSV Group B,Metapneumovirus European strains American strains CoV-SARS CoV-OC43 CoV-229E HPIV-1 HPIV-2 HPIV-3 HPIV-4 HPIV-4a HPIV-4b Chlamydia pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae,Influenza A H7

17、 Rhinovirus Herpes Simplex Virus 1, 2 Varicella Zoster Virus Cytomegalovirus HIV-1 HIV-2 Measles virus Mycobacterium tuberculosis Pneumocystis carinii Coxiella burnetti,Current Respiratory Panel,In Progress,Enterovirus Adenovirus,HEMORRHAGIC FEVER PANEL,Ebola virus (Zaire) Ebola virus (Sudan) Marbur

18、g virus Crimean-Congo hemorrhagic fever virus Rift Valley virus Hantaan virus Seoul virus Yellow Fever Kyasanur Forest virus Lassa virus (lineage IV),Ebola virus (Reston) Junin virus Machupo virus Dobrava virus Tacaribe virus Guanarito virus Sabia virus LCMV Chikungunya virus Dengue virus group Borr

19、elia burgdorferi Herpes Simplex virus (1, 2) HIV-1, -2 Neisseria meningitidis Rickettsia Spotted Fever Group Plasmodium sp,Current Panel,In Progress,A,C,B,Lab Network,Epidemiology Microbiology research service training,infectious agents,samples clinical data,GLOBAL SURVEILLANCE NETWORK,Animal models

20、 drugs vaccines,Drosten, Hamburg Lipkin, New York Mackenzie, Perth Pauli, Berlin Peiris, Hong Kong Qian, Beijing Perez-Brena, Madrid Swanepoel, South Africa Webster, Memphis Wen, Shanghai,Multiplex PCR-XMAP,多重PCR-液芯联用技术,Diagram,LUMINEX XMAP技术：多指标并行检测系统（流式荧光技术或液芯技术）,技术,GENOCA Templex PCR技术:多指标并行扩增,Su

21、per Primer,Templex PCR技术原理,Templex PCR技术原理,巢示PCR引物提高了引物间的相容性 低浓度的特异性引物降低了反应过程中的背景值. 仅有的一条生物素标记的引物使得更容易扩大生产以及质量控制.,流式荧光技术（液芯）原理XMAP,荧光编码微球技术,每种微球的地址由两种红色荧光颜料的掺入比例唯一决定,颜色编码的微球,共价交联技术,反应模式,Multiplex Assays with Color Separetion,Luminex 100多功能流式点阵仪,流式荧光检测仪,呼吸道感染型11种DNA基因组的病原体,呼吸道感染型13种RNA基因组病毒型病原体,蛋 白 质

22、 芯 片,MASATM液相芯片,一. 基本原理 微小的乳胶颗粒（Beads,微球）分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的蛋白（如抗原抗体）以共价方式结合到特定颜色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合，再加入被检测物（被测物可以是血清中的抗原、抗体、或酶等）。,固定生物分子的微球,悬浮点阵,多分析物组合灵活,The Red Laser is Used to Identify the Bead Code,The Green Laser is Used to Identify the Reporter Signal,液相芯片的特点： 液相芯片的独特设计使得它拥有常

23、规的蛋白质检测方法所不具备的特点： 1. 重复性好 2. 通量大 可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析在35-60分钟内可对96个不同样本进行检测 。,3. 灵活性好 4. 灵敏度高 5. 信噪比好 6. 操作简便，不需洗涤，耗时短 7.液相环境更有利于保持蛋白质的 天然构象，也更有利于探针和被 检测物的反应,Hybridization Time,% of Maximum,Minutes,MASATM和ELISA灵敏度的比较,基因芯片（Gene Chip）,何谓基因芯片： 基因芯片（或DNA Chip,或Microarray）又称DNA微阵列，是指固定在固相载体上的高密度DNA微点阵。

24、即将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（点与点间距一般小于500m） 排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。 基因芯片的种类： 按应用，基因芯片主要可分为3类：1、表达谱基因芯片：主要用于基因功能研究；2、诊断基因芯片：如肝癌诊断芯片、糖尿病诊断芯片、病原体多基因诊断芯片等：3、检测芯片：如商品检疫芯片、病原体检测芯片等。,Viral Pathogen Custom Microarray,病原体诊断基因芯片,High Sensitivity Scanner,0.05 CPSM CPSM - what does it mean? Chromphores per square micron

25、 0.05 cpsm or 5 molecules of dye per 10 micron pixel. Competitors best is 10 molecules of dye per 10 micron pixel. To achieve high sensitivity: Dynamic Autofocus Laser stability Control High resolution scanning,0.05 CPSM,Detect 5 dye molecules in 10um pixel,0.1 CPSM,Detect 10 dye molecules in 10um p

26、ixel,eArray Delivering Custom Content and Formats,Back,Name Your Design,Select Array Format,Prokaryotic Array Custom Designs,Agrobacterium Anopheles (AG) and Plasmodium (PB).ie. malaria microarray Archaeon, Halobacterium sp. Bacillus cereus Bacterial pathogens Bifidobacterium longum Bordetella Pertu

27、ssis Chlamydophila abortus Culex pipiens Cyanobacterium Synechocystis E.Coli Erwinia carotovora atroseptica/Solanum tuberosum Lactobacillus plantarum Methylobacterium extorquens AM1 Plasmodium falciparum Pseudomonas aeruginosa S.aureus; N.meningococcus; E.coli Salmonella typhimurium Staphylococcus a

28、ureus,SARS Coronavirus,Human Coronavirus OC43,Human Coronavirus 229E,GreeneChip 1.1,Sample: WNV NY99 100,000 RNA copies/ml 32/45 top hits are WNV-specific; remainder are JEV group or other flavivirus-genus probes,Collaboration between the Greene Laboratory of Columbia University, ICTV , Northeast Bi

29、odefense Center, and Agilent Corporation,Sample: SARS-CoV 100,000 RNA copies/ml,GreeneChip 1.1,Columbia (Briese, Lipkin, Liu, Lussier Palacios), ICTV (Bchen-Osmond), and Agilent (Hirschberg) 251,000 sequence database, 1710 vertebrate viruses,未知新病原体的发现,发现新病毒的主要技术路线,表达cDNA文库筛选技术 宽范围PCR（基于保守序列的PCR） 差异显

30、示技术： 代表性差异分析（RDA） 抑制性消减杂交（SSH） 序列非依赖的扩增： 随机PCR（randome PCR） 序列非依赖的单引物扩增（SISPA）,cDNA 文库筛选,cDNA文库筛选常被用来检出RNA病毒的核酸。 收集病毒颗粒（感染组织匀浆过滤，或者血浆超速离心以收集病毒颗粒），提取RNA，逆转录成c DNA ,构成c DNA表达文库。 最常用的表达型载体是gt11,插入的c DNA片断可以融合蛋白形式表达，保留抗原性。 病毒在感染过程刺激机体产生特异性抗体，因而常用患者恢复期的血清对c DNA库进行免疫学筛选。,HCV的发现,1989年Choo等小组 从被感染的黑猩猩的血浆中用超

31、离心的方法收集病毒颗粒，提取核酸（包括RNA和DNA），充分变性后逆转录c DNA，构建gt11 c DNA表达文库。 用慢性非甲非乙肝炎患者的血清筛选库，结果得到一个反应性克隆。 该c DNA克隆与正常人的DNA不杂交，说明他来源于外源基因组。 与被感染黑猩猩的肝组织RNA杂交，与未感染黑猩猩的肝组织RNA不杂交，提示该因子可能就是输血相关肝炎的一种致病因子。 发现该c DNA克隆仅与被感染黑猩猩的肝组织RNA杂交，而与DNA不杂交，提示该因子是一种RNA病毒。序列分析表明属于黄病毒科，命名为HCV。,基于保守序列的聚合酶链式反应（Consensus Sequence Based PCR）,

32、基本原理：基于保守序列的聚合酶链式反应（以下简称保守序列PCR）就是通过已知的一种生物和另一种生物之间高度保守的DNA序列设计引物，用PCR的方法去扩增另一种生物的未知DNA 序列。当一种未知病毒与可能与另一种已知的病毒相似时，可以根据已知病毒的保守序列设计引物，然后用PCR方法扩增出未知病毒的相应序列。,新型汉坦病毒的发现,1993年5月，在美国西南部爆发了一场高死亡率的急性呼吸道疾病。血清学试验中发现。病人的血清能与一些已知的汉坦病毒抗原起交叉反应，提示该病的病原体有可能是一种以前未能发现的新汉坦病毒。 1993年Nichol等根据已知的汉坦病毒基因组M片断的包膜糖蛋白G2编码区的保守部位

33、设计了PCR引物，扩增出一个278bp的DNA片断。序列分析表明，与其他个血清型的汉坦病毒至少有30%的不同源性，在系统发生上与IV型希望山病毒（Prospect Hill virus,PH）最为接近，说明该病毒是一种新的汉坦病毒。,基于保守序列的PCR,技术要点-引物设计 一种是简并PCR，其所用的是一个混合的引物库，包含了已知某种病毒高度保守氨基酸区域的所有可能的核苷酸序列 （设计引物之前，列出该病毒家族所有成员的对比图 ），但简并度很高时有效引物的浓度不足。 另一种是根据密码子的偏向性设计单一的引物：依照高度保守的氨基酸序列，选择每个氨基酸最常用的密码子组成一条完整的引物。适用于分离亲缘

34、关系较近的相关序列，但对亲缘关系较远的序列则不能检出。,简并引物设计,目前已经可以有计算机软件来设计，常用的软件有: Primo Degenerate 3.4 Genefisher CODEHOP Simple degenerate primer(U : Oregon),差异显示技术（differential display),最先是Liang和Pardee等提出用于比较两种细胞或同种细胞在不同状态下mRNA表达差异的技术; 现在已经发展了多种分离和鉴定差别表达基因的技术，其中代表性差异技术(RDA)和抑制消减杂交技术(SSH)以其灵敏度高、假阳性率低和重复性好而相对更受欢迎,代表性差异分析（

35、Representational Difference Analysis ,RDA）,基本原理：病原微生物感染靶器官或组织时，同时带入自己的基因组，这样病理组织就比正常组织多出了病原体基因组。RDA可以把单拷贝的外源基因组从高度复杂的人染色体DNA本底中检测出来。,RDA流程,分别提取实验组(Tester)和对照组(Driver或驱动子)的总RNA或者DNA 用四碱基内切酶充分酶切，分别连上寡核苷酸接头，并用特异性的接头引物扩增 扩增产物去除接头，再在实验组扩增子上连上新接头，将两份扩增子杂交，以新接头为引物进行扩增 只有那些未能与驱动扩增子杂交而自身退火的样品DNA的两端因都能与引物配对才以

36、指数形式扩增，而待检样品单链DNA和驱动样品DNA只有一端与引物配对而线性扩增,GBV病毒的发现,GB肝炎是Deinhardt等在1970年首先报道。后研究表明GB肝炎因子不同于甲-戊型肝炎病毒。 1995年Simons等用GB肝炎因子感染狨猴取同一狨猴感染前和感染后急性期的血浆，分别提取总RNA，逆转录成cDNA作RDA分析，7个cDNA克隆序列分析表明，属于两种黄病毒，与HCV有一定同源性命名为GBV-A和GBV-B。,RDA的缺点,其本身不能消除不同mRNA分子丰度的差异,因而往往需要进行多轮杂交 而每轮杂交都涉及到接头的连接和去除效率问题以及绿豆核酸酶消化去除单链等操作,抑制性消减杂交

37、技术（SSH）,1996年Diatchenko等将抑制性PCR和减法杂交结合起来，创立了SSH技术。 该技术通过接头特异性的引物选择性地扩增差异表达基因片段的同时，可以抑制非靶片段的扩增。 利用杂交二级动力学原理巧妙地在减法杂交过程中消除了不同mRNA分子间丰度的差异，因而通过一次减法杂交可将差异片段富集1000倍以上。一般只需两轮杂交，3-4天即可得到几十或上百个差异片段,SSH的基本步骤,RDA与SSH,原理相似：都是建立在PCR技术和减法杂交的基础上。RDA是先对样品的cDNA进行扩增再杂交，而SSH则是先减法杂交再扩增。两者都具有高效、重复性好、阳性率高等优点。 共同的缺点：由于驱赶子

38、和待检测的标本的背景往往不完全相同，富集的差异片段可能不是微生物学鉴别的有用标记。,最新的技术,序列非依赖的扩增法： 随机PCR(random PCR)技术 序列非依赖的单引物扩增(SISPA: sequence independent single primer amplification）,Random PCR,基本原理：在合成随机引物时在其加上一个相同的接头，这个接头含有一个限制性的酶切位点可以便于随后的片断克隆进载体，然后对插入序列测序并进行BLAST比对即可初步获得未知病毒的种系来源信息。这种随机PCR法不仅可以检出DNA病毒也可以检出RNA病毒。 利用这种方法Allander等在2005年在呼吸道感染的标本中发现了一种人的parvovirus； Stang A等也在2005年使用这种方法在慢性疲劳综合症的病人漱口液中意外检测出了HSV-1型病毒。,SISPA,SISPA是单引物扩增法中最常用的一种方法，用于鉴定低浓