生物化学课件003氨基酸与蛋白质.ppt

1、第六节域、三级结构和球状蛋白质在二级结构和超二级结构的基础上进一步卷曲折叠多肽链，组装成几个相对独立的近球形三维实体。 另一方面，结构域domain、motif (模块)、结构域多为球状蛋白质的折叠单位小的蛋白质分子或亚单位为单一结构域。 域中一般有氨基酸残基。 结构域之间大多连接着柔软的肽段，形成所谓的铰链区域，使结构域之间的相对移动成为可能。 结构域承载着一定的生物学功能，几个结构域可以协同工作，表达蛋白质的整体功能。 例：脱氢酶类多肽主链有两个结构域，一个是NAD结合结构域，另一个是催化作用结构域，两者组合在脱氢酶的脱氢功能区域。 域间的裂纹是酶的活性部位，也是反应物的出入口，EF手：钙

2、结合蛋白质中含有Helix-Loop-Lelix结构，锌指： DNA结合蛋白质中结合了2个His、2个Cys、1个Zn。 亮氨酸拉链： DNA结合蛋白质中，亮氨酸链组成的拉链结构，二、三级结构，整个多肽链在二级结构、超二级结构和区域上旋转、折叠形成的特定空间结构。 三级结构是多肽链中所有原子的空间构型。 大的球形蛋白质(200个氨基酸以上)通常包含几个结构域。 一、三级结构的特点是，在一级结构上差异很大的氨基酸碱基大多在三级结构上相近。 球形蛋白质的三级结构紧密，水分子的大部分从球形蛋白质的核心排出，极性基之间以及非极性基之间的相互作用成为可能。 主要是二硫键，二硫键不指导多肽链的折叠，三级结

3、构形成后，二硫键可使该结构稳定。 2 .维持三级结构的作用力、氢键、范德华力、分子间及基间作用力、取向效果：极性基间诱导效果：极性和非极性基间分散效果：非极性基间、疏水相互作用、离子键、盐键、共价键健，5，表面多有空位2 .具有明显的折叠层次3 分子呈球状或椭球状，4、疏水侧链嵌入分子内部，亲水侧链露出外观，与第七节亚基缔合为四级结构，部分对称的低聚蛋白质由两个或多个非对称的同等结构成分组成，这种同等结构成分称为原体。 例如，血红蛋白22由两个原体构成。 有时也将原体称为单体。 一、关于四级结构的若干概念，1、亚单元和单体、2、单体蛋白质、3、原子、四级结构的蛋白质各自的球状蛋白质称为亚单元(

4、或单体)，亚单元一般由一个多肽链组成。 只有一个亚基的蛋白质称为单体蛋白质。 二、季结构缔合的驱动力、疏水作用、极性基之间的氢键和离子键、二硫桥、亚基之间相互作用的表面不同，形成微管、病毒壳等线状或螺旋状的高分子化合物。 三、亚基间缔合方式，1、同多聚合和杂多聚合，2、同种缔合和异种缔合，1、比表面积降低，蛋白质稳定性2、蛋白质结构3 .提高基因编码的效率和经济性。 4 .收集酶的催化基，提高催化效率。 5 .形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。 6 .适当降低溶液的渗透压。 7 .具有协同效应和其他结构效应，实现酶活性的调节，四、季聚会在结构和功能上具有优势，其他结构蛋白质的其他结构部位与效果的

5、结合可以改变蛋白质的结构，影响活性部位。 五、低聚蛋白和其他结构效应，其他结构蛋白除活性部位(结合基质)外，还有其他结构部位(结合调节物)。活性部位和其他组织部位属于不同的亚基(活性亚基和调节亚基)，活性部位之间以及活性部位和调节部位之间可能因蛋白质构象的变化而相互作用。 包括不同结构效应、不同结构效应、不同结构位点与效果结合对活性位点的影响、同促进效应(同位效应)、一个配体结合对后续同种配体结合到其他位点的能力的影响、(正)协同效应和负协同效应。 同位素效应一般指活性部位之间的效应。 同位效应是不同结构效应的基础，不同结构效应对同位效应的一种修饰、异位效应(异位效应)、正协同效应、一种配体的

6、结合促进后续配体的结合，可视为s型配体结合曲线。 负的协同效应性，一个配体的结合抑制促进后续配体的结合。正效果、促进活性部位与配体结合的另一结构效果。 负效应物是抑制活性部位与配体结合的另一种结构效应物。 第七节蛋白质结构与功能的关系，8段的直螺旋组成分别命名为a、b、CH，拐角是由18个氨基酸组成的松弛肽段(随机卷曲)。 4个Pro残基分别在1个拐角，另外4个是Ser、Thr、Asn、Ile。 血红素亚基呈扁平状，与肌红蛋白表面的洞穴结合。 一、肌红蛋白的结构和功能，一、肌红蛋白的三级结构，肌红蛋白是哺乳动物肌肉储氧的蛋白质。 由一条多肽链(珠蛋白)和血红素亚基组成。 球状分子，单域。p25

7、5,2、2、2、肌红蛋白的氧结合曲线、二血红蛋白的结构和功能是在血液中O2结合运输，接近球体，4个子单元分别位于四面体的四角，各子单元中有血红素子单元。 链的三级结构与肌红蛋白很相似。 1、血红蛋白结构，成人： HbA: 22 98%，HbA2: 22 2%胎儿： HbF 22早期胚胎： 22， 2、由于血红蛋白的氧键曲线、4个子单元之间存在正的协同效应，因此其氧键曲线、肌红蛋白与血红蛋白的氧键曲线的比较，增加了CO2的浓度，降低了pH提高了血红蛋白子单元之间的协同效应，提高了血红蛋白的O2 3、耳效应及其生理意义，血红蛋白中有CO2与BPG的结合部位，因此血红蛋白也可携带CO2。 波耳效应，

8、BPG是血红蛋白的负效应物。 bpg (2，3 -二磷酸甘油酸)通过与其两个亚基形成盐键，使血红蛋白的脱氧状态的构象稳定，降低脱氧血红蛋白的氧亲和力。 BPG进一步提高了血红蛋白的供氧效率。 在肺部，由于PO2超过100torr，即使没有BPG，血红蛋白也饱和，在组织中，PO2低，BPG降低了血红蛋白的氧亲和力，增大了血红蛋白的缺氧量。 (1)高山适应和肺气肿生理补偿变化BPG升高。 (2)血库存血时加入肌苷就会变成BPG。 4、BPG的不同结构效应、BPG、3-二磷酸甘油酸、协同效应、波耳效应、不同结构效应可使血红蛋白的供氧能力达到最高效率，三、免疫球蛋白的结构和功能，1、抗原和抗体、抗原，

9、抗原进入异体机体后抗原性为抗原分子表面的特殊化学基团(一次结构或空间结构) 包括抗原性、免疫原性和抗原特异性。 免疫原性是指诱导特异性免疫反应的能力。 抗原特异性是指与抗体特异性结合的能力。 抗原决定簇、抗原决定簇的作用被免疫活性细胞识别，使免疫活性细胞活化而产生抗体。 与相应抗体的Fab结合。 抗体是抗原刺激的免疫应答中b淋巴细胞产生的糖蛋白，是与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，又称免疫球蛋白。抗体的特征、高度特异性、多样性，几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，在人体内的任意时刻存在约10，000种抗体。 抗原抗体反应条件：抗原决定簇与抗体结合部位的构象互补。 两者分别有对

10、应的化学基团，通过作用力使两者结合(离子键、氢键等)，2、抗原抗体反应，抗体为2价，抗原为多元。 抗体极端过剩，抗原分子的所有价格都被抗体饱和，可溶。 抗原一抗体比例适中，形成网状抗原抗体复合物，不可溶。 抗原极端过剩，抗体饱和，可溶。基于抗体抗原相互作用的生化分析方法、酶联免疫吸附测定(ELASA )、Western印迹、第八节蛋白质的分离、纯化和表征、一、蛋白质的酸碱性和等电点、等离子体点、中性盐(Ca2、Mg2、Cl -、HPO42-)影响滴定曲线的形状和等电点。 盐离子浓度为0时的等电点称为等离子体点。 等电点测定方法、溶解度法、聚焦电泳法、化学组成法测定最低分子量SDS-PAGE法凝

11、胶过滤法渗透压法扩散系数法沉降平衡法、二、测定蛋白质的大小和形状、分子量的方法、1、根据分子组成测定最小分子量，例如肌红蛋白的100%=，55.8， 0.335，=16，700， 2、利用葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量、3 .由渗透压用半透膜分隔蛋白质溶液和纯水，取得渗透平衡后测定其渗透压算出分子量，c :浓度(克/升) r :气体常数(0.082升/大气压/克分子/K开尔文温度) t :绝用大气压表示的渗透压，用4.sdspage测定蛋白质的分子量，蛋白质分子直径在1-100nm之间，水溶液中有胶体溶液的通透性(不能通过布朗运动、丁丹现象、半透膜)。 1 .使蛋白质胶体溶液稳定化的主要原因

12、，蛋白质表面极性基构成的水合膜，非等电状态时，同种电荷的相互排斥。 2 .选择性沉淀蛋白质的方法、盐析法、大量中性盐(NH4)2SO4、Na2SO4、Nacl、蛋白质脱水层沉淀。 有机溶剂沉淀法、水合膜破坏、介电常数降低、PEG、丙酮、乙醇等重金属盐沉淀、pHpI带负电荷、与重金属离子(Hg2、Pb2、Cu2等)不溶性沉淀。 当生物碱试剂和某些酸类沉淀法，pH小于等电时，蛋白质有正电荷，容易生成生物碱试剂和酸类负离子和不溶性沉淀。 生物碱试剂：丹宁酸、苦味酸、钨酸。 酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 加热改性沉淀、等电点沉淀法是指受理、化学因子的影响而丧失蛋白质生物活性。 四、蛋白质改性、强酸和强

13、碱有机溶剂：破坏疏水作用； 去污剂：去污剂均为双亲分子，破坏疏水作用的还原性试剂：尿素、-硫基乙醇； 盐浓度：盐析、盐溶； 重金属离子： Hg2、pb2与-SH或带电基团反应。 温度； 机械力：搅拌或研磨中的气泡等。 1、改性要素在制备活性蛋白质时严格防止蛋白质改性，2、蛋白质改性后出现的现象是，生物活性丧失硫羟基外露，分子结构伸长缓慢，易被蛋白酶水解。 溶解度降低，沉淀，粘度增加。 3、蛋白质改性的实质、二次键(有时包括二硫键)被破坏，天然结构崩溃。 但改性不会增加一级结构的破坏、不可逆改性、蛋白质改性、可逆改性、预处理粗分级浓缩保存、五、蛋白质分离纯化的一般原则、纯化的本质、产品(prep

14、aration )的纯度或比活性。精制的一般程序、电泳、预处理、粗分离、细分离、生物组织、无细胞提取液、破碎、溶解、差速离心分离、选择沉淀法、亲和色谱、离子交换色谱、精制超声波振动、与砂研磨的高压挤出、溶菌酶处理(肽聚糖分解电印均化(homogenizer )超声处理(ultrasonication )，提取植物组织和膜蛋白、超声波或去污剂使膜解聚后，用适当的介质提取，(NH4)2SO4分级沉淀法(盐析) 等电点选择沉淀法有机溶剂分级沉淀法热处理选择沉淀法生物碱或三氯乙酸选择沉淀法，2，粗分级一般使用选择性的色谱、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、吸附色谱亲和色谱、疏水色谱(反相HPLC )、电泳、

15、自由界面电泳(凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等)、盘状电泳等电聚焦、密度梯度离心、4、保存、结晶保存能否结晶不仅是纯度的指标，也是判断产品是否有活性的指标。 纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。 结晶方法：使溶液稍微过饱和。 降低温度，盐析，加入有机溶剂，调节pH，投入种晶。 冻干粉保存、溶液保存、加入防冻剂(50%甘油)后保存-20至-70。 蛋白质的溶解度分离导致电荷的差异分离导致分子大小分离导致配体特性的各向异性分离(亲和色谱)导致选择性吸附分离(物理吸附)疏水性的差异分离纯化蛋白质的主要方法， 盐析法PEG沉淀法有机溶剂等电点沉淀法重金属盐选择沉淀法(pHpI蛋白质带负电荷)生物碱和酸选择沉淀法(pHpI，蛋白质带正电荷)热处理沉淀法(铜锌SOD，65，15分钟，稳定，1，按溶解度差分离：选择沉淀法，pI时，分子电荷为零，蛋白质分子间的静电排斥消失，等电点沉淀蛋白质的盐溶和盐析、盐溶、低盐浓度时、蛋