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文档简介
1、实验九 动物细胞内微丝结构的观察 (鬼笔环肽标记法),实验目的,1. 了解鬼笔环肽标记微丝结构的原理。 2 观察微丝束(应力纤维)在动物细胞内的分布。 3 学习细胞固定,穿透,染色等技术。 4 巩固荧光显微镜的使用技术。,实验原理,Actin-Tracker Green是一种Actin绿色荧光探针,可以用于培养细胞或组织切片的Actin特异性荧光染色。 Actin-Tracker Green探针为荧光染料FITC标记的毒蕈肽(phalloidin),即phalloidin-FITC,其分子量约为1251.4,最大激发波长为496nm,最大发射波长为516nm。 可以用于细胞或组织内的微丝(mi
2、crofilament)的荧光检测。 使用时的推荐稀释比例为1:200。如果每个片子需要使用200l染色工作液,每个包装的本产品足够用于200个片子 的染色。,主要仪器与溶液,主要仪器 荧光显微镜、移液器(1000ul 和100ul) 材料:细胞爬片,两人一孔。 溶液 PBS配制的3.7%甲醛溶液。 0.1% Triton X-100的PBS洗涤液 含有5%BSA和0.1% Triton X-100的PBS按照1:200的比例稀释Actin-Tracker Green,实验步骤,a 用PBS洗涤细胞或组织切片2次。每次0.4ml. b.弃去洗涤液,用PBS配制的3.7%甲醛溶液室温固定细胞或组
3、织切片约10分钟。注意:甲醇可以破坏actin蛋白,因此不能使用含有甲醇的固定液。并且尽量使用不含甲醇的甲醛。每孔0.2 ml. c.弃去固定液,用含0.1% Triton X-100的PBS洗涤2-4次,每次约5分钟。每次0.2 ml. d 弃去洗涤液,把Actin-tracker Green染色工作液按照每个片子约100l的比例滴加到片子上,室温避光孵育30分钟。,实验步骤,e. 用含0.1% Triton X-100的PBS洗2-4次,每次约5分钟。每次200ul。 f. 在载玻片上加一滴PBS, 反扣盖玻片(生长有细胞的一面朝下),随后可以用荧光显微镜进行观察。 为长期保存,可以在片子自然干燥后封片并于4避光保存,保存时间可长达6个月左右。,实验结果,荧光显微镜 激光共聚焦显微镜 显示的细胞中的微丝分布,作业,1 为什么不能使用细胞松弛素B标记微丝结构? 2 Triton-x 100溶液处理细胞的作用是什么? 3 本实验中能使用甲醇固定细胞吗?为什么? 4 动物细胞内重组表达的GFP-Actin 融合蛋白
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