克隆载体解析

1、基因工程的克隆载体Genetic Cloning Vector基因工程的基本程序及研究策略 目的基因的制备( donor DNA )载体DNA及其改造(Vector DNA)体外DNA重组(DNA recombination )重组DNA的转化( Transformation)重组体的筛选鉴定与克隆扩增( identification & clone amplification)目的DNA在受体细胞中的表达(gene expression)基因工程的目的基因克隆获得目的基因基因表达使受体的新性状表现，获得大量目的蛋白In vivo expressionIn vitro expression载体

2、-基因工程中的重要工具 载体(vector)：携带外源DNA进入宿主细胞的工具 载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞2. 为外源基因提供复制能力或整合能力3. 为外源基因的扩增或表达提供条件 载体的两种扩增方式-自主复制型载体和附加载体克隆载体（cloning vector)定义(definition)特点(features)常用载体介绍(several vectors)第一节 概述introduction一、概念克隆载体（cloning vector)：用于携带目的基因（外源基因）进入受体细胞进行复制、扩增的工具。二、特点(vectors which are used in gene

3、tic engineering should:)1、能独立复制，具有复制子（replican)replican：基因组中能独立复制的最小单位， 含复制起始点(ori)和复制终点。* DNA的复制由ori控制原核细胞的染色体和质粒有固定的ori真核细胞的染色体有多个ori按复制起点划分克隆载体质粒复制型复制起点来自质粒ARS复制型ARS（autonomus replicative sequence)，或称染色体复制型病毒复制型复制起点来自病毒混合复制型 同种生物复制起点混合质粒形式存在；质粒或病毒形式存在 不同生物复制起点混合穿梭载体（shuttle vector）两种生物中均以质粒形式存在；在

4、一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中以质粒或病毒形式存在复制起点种类与拷贝数间的关系1) 质粒复制起点类型： 低拷贝（严紧型，1-2 copies，受宿主染色体基因控制） 高拷贝（松弛型，20 copies，受宿主染色体控制较弱）2) ARS型载体：拷贝数较高（约20 copies）3) 病毒型复制起点：高拷贝2、属于松弛型复制子(relaxed plasmid)3、具有复制非必需区4、有一个或多个单一酶切位点，即多克隆位点多克隆位点（Multiple cloning site,MCS）： 一段人工合成的DNA序列，其上含有密集排列的多种单一限制性内切酶位点，以利于不同来源的外源DNA插入

5、载体。5、具有筛选标记6、分子量合适（3-10kb)7、高拷贝数拷贝数（copy):一个细胞内存在的分子数8、生物安全性好三、 克隆载体必备条件（1） 具有复制起点（2） 具有抗菌素抗性基因（遗传标记）（3） 具有若干限制酶单一识别位点，允许外源基因插入（4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。四、常用克隆载体种类Classification of cloning vectors) 质粒（plasmid) l噬菌体（bacteriophage l) 粘粒（cosmid） M13噬菌体（bateriophage M13） 人工染色体(artificial chromosome)第二节常用克隆载

6、体介绍Several cloning vectors一、质粒（plasmid)（一） 一般特性(features)Plasmid：染色体外能够进行自主复制的遗位。 包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体 多为环状双链DNA可自我独立复制天然存在：F质粒、R质粒等编码重要遗传信息不相容性质粒的不相容性：是指在没有选择压力的情况下， 两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。质粒的不相容性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互

7、干扰造成的。（二）分类(classification)*大小：小型质粒(60kb)*功能：F质粒、R质粒*宿主：窄宿主范围质粒：ori特异，仅能在一种宿主中复制宽宿主范围质粒：ori不特异，可在多种宿主中复制*复制类型：严紧型质粒：复制受宿主细胞的严格控制低拷贝数（1-2copies/cell)松弛型质粒：拷贝数高(10-200 copies/cell)复制仅需DNA聚合酶I，不需蛋白质合成宿主细胞蛋白质合成及染色体复制停止时，可大量扩增至上千份（氯霉素）*构型： 超螺旋型（supercoiled circle,SC) or 共价闭环双股DNA( covalently closed circl

8、e,CCC) 开环型（opened circle,OC） 线形（linear circle,LC)（三）质粒的命名 用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上 质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez， 322为编号。（四）克隆质粒的改建(how can cloning vectors be made)1、改建质粒的目的调整质粒结构、提高转化率2、常用手段： 减小分子量 引入MCS 引入具有多种用途的辅助序列3、克隆质粒的发展趋势向

9、天然质粒中引入选择标记, pSC101多个质粒重组，增强选择标记,过大,pBR313减小复制非必需区,缩小分子量,增大容量,pBR322调整质粒结构，完善载体功能（减小分子量、引入MCS及辅助序列）4、发展概况 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利 用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆 中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及

10、各种探针型载体。 9.09kb单标记、复制效率低（平均每个寄主细胞仅有12个拷贝）双标记，50%以上的复制非必需区物理图谱（physical map): 在DNA分子上标明限制性内切酶位点、数目、排列顺序及特 征性功能标记的图形。又称为限制图谱（restriction map)载体物理图谱识图要求1、载体大小2、载体类型3、载体组成物理图谱（physical map)4、载体主要元件（特点）及其应用（五）常见人工构建质粒的分类:according to their functions,plasmids can be classified into:人工构建的质粒根据其功能及用途分为:1.多拷贝

11、质粒 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。2.测序质粒sequencing plasmid3.整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列， 便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上4.穿梭质粒shuttle plasmids 含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制5.表达质粒expression plasmids 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达（六）常用质粒介绍detail introduction of several plasmids1、 pBR32277年Boli

12、ver构建 质粒命名原则 4.36kb 双标记 分散的多个单一酶切位点 插入灭活 双抗菌素对照实验插入失活、双抗菌素对照实验pBR322衍生质粒2、 pUC18/19pBR322的重要衍生质粒乳糖操纵子(lac Z operon) lacZ基因编码b-半乳糖苷酶 lacI基因编码阻遏蛋白,使lacZ不能表达 诱导物与阻遏蛋白结合,lacZ表达乳糖操纵子的表达调控Regulation of LacZ expressionpUC载体蓝白斑筛选的原理插入失活1how to select positive clone using a vector with LacZpUC载体(含lacZ、lacI基因

13、）诱导物(IPTG)lacZ表达b-半乳糖苷酶N端片段（a-肽）宿主细胞lacZDM15缺陷型b-半乳糖苷酶b-半乳糖苷酶X-gal变兰色pUC载体蓝白斑筛选的原理插入失活2pUC载体(含lacZ、lacI基因）外源基因插入lacZ失活不产生b-半乳糖苷酶N端片段（a-肽）X-gal不变色，呈白色 3、 pGEM系列pGEM-1MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子pGEM-1MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子1、可进行体外转录 转录具有特异性 可分别转录插入片段的两条链 转录产物可制备体外翻译的模板、探针及反义RNA2、为插入片段的测序提供特异引物位点pGEM-3/4ZMCS位于

14、lacZ基因内部 插入失活蓝白斑筛选 具有SP6、T7启动子pGEM-3Zf(+)/(-)引入丝状噬菌体f1(+)/(-)复制起始点 可以产生单链DNA，并分泌至上清中，便于对插入片段进行测序 F1的方向(+/-)决定复制哪一条链4、 T-vector用于PCR产物的直接克隆 载体DNA两条链的5端有一个游离的T：PCR产物的直接克隆 SP6、T7启动子：体外转录、为克隆产物的测序提供特异性引物 插入位点两侧的酶切位点：为回收克隆片段进行亚克隆提供便利的酶切位点5、pCDNA3穿梭载体 穿梭载体（shuttle vector) 即可以携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细胞中表达的载

15、体。小 结 (conclusions)质粒的发展趋势：调整质粒结构、提高载体效率：减小分子量、引入MCS引入多种用途的辅助序列: lacZ、lacI基因：蓝白斑筛选 SP6、T7RNA聚合酶启动子：体外转录 F1复制起始点：产生单链DNA 真核启动子：穿梭载体二、 l噬菌体载体Bacteriolphage l（一）噬菌体的分子生物学biological features of bacterophage l1、噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和-DNA组成2、-DNA：线状双链DNA分子，全长48.5kb两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端， GGGCGGCGACCT, CCCGCC

16、GCTGGA，称为 Cos位点（cohesive end）或cos区。功能相近的基因在基因组中聚集在 一起。l 噬菌体生物学性状介绍3、基因组成： 48.5 kb in length；Linear or circular genome (cos ends) Cos位点（cohesive end)： DNA分子两端各有一个12碱基长的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称 cos 位点 左臂（编码外壳蛋白）：头部基因（7个）、尾部基因（11个） 右臂（负责裂解宿主细胞、DNA自主复制以及调控)：裂 解基因（2个） 中间段(控制基因组整合到寄主基因的基因)：DNA复制及溶菌生长非必需区（重组基因、正调

17、控基因、负调控 基因）、DNA合成基因cos位点的作用4、生活周期温和性噬菌体（二）DNA载体的构建建立克隆载体前需要解决2个问题：Two key points of preparing l vectors1）包装容量有限：DNA分子只能增加5%的大小，意味着只能插入3kb的DNA分子。2）酶切位点复杂： 基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成基因组。 两种解决方案：1）缩短长度：DNA上约有40-50%的DNA片段是复制、裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。2）修饰酶切识别位点：利用自然选择法获得限制性位点缺失的品系。天然的-DNA上有多个

18、酶切位点，如：EcoRI 5个， HindIII 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。DNAProtein coat phageLong (left) armshort (right)armcoscosNonessential region12bpExogenous DNA (20-23 kb) phageViruses that caninfect bacteria. 48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends)Lytic phase(Replicate and release)Lysogenic phase(integrate

19、 into host genome) 自然选择法：利用一个产生EcoRI的大肠杆菌， 大部分侵入细胞的 DNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活， 这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了（三） 噬菌体载体1、基本组成元件components of l vectors Cos位点 左臂（头尾基因） 右臂（裂解基因） 酶切位点l 噬菌体载体2、类型types of l vectors： 插入型载体：含有单个或多个单一酶切位点供外源基因插入 替换型载体：含有一对或多对酶切位点便于外源基因替换 插入型载体(insertion vector) 该类载体经改造后的长度为37kb，为包装的下限，它

20、本身也能被包装，其允许的插入片段最大为17.9kb（54.9-37kb）。 由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（0- 17.9kb）gt10：可以携带8kb的DNA分子，插入位于cI基因内的单一的酶切位点EcoRI。插入失活导致裂解循环，从而很容易识别重组子。ZAPII：含有多聚接头，可以使用六种不同的限制性内切酶插入约10kb的新的DNA分子，通过lacZ基因的插入失活鉴定重组子，不能形成蓝色的噬菌斑。 替换型载体(replacement vector)该类载体经改造后的长度约为40kb，在非必需区域内含有两个相同的酶切口，两者间的距离为14kb长，使

21、用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。特点：容量大，且有一个下限：40-14kb=26kb， 包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。WES. B：两个 EcoRI位点跨越替换区域，根据分子大小筛选重组子。EMBL4：可以插入20kb的DNA分子，可利用EcoRI、BamHI、SalI替换填充片段，因此可以插入不同粘端的DNA片断。lEMBL3l噬菌体载体3、体外包装将重组的噬菌体DNA分子与噬菌体头、尾部蛋白混合，通过自动包装，体外组成完整的具有极强感染性噬菌体颗粒的过程。噬菌体载体 外 源基因替换/插入重组噬菌体DNA噬

22、菌体头、尾蛋白体外包装子代病毒颗粒感染宿主感染力较低感染力极强以感染方式导入细胞的频率可达106108/gDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103105/ gDNA大量扩增目的DNA l噬菌体载体4、用途： 构建文库，容量大5.-DNA作为载体的优点merits of l vectors 1) -DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌2) -DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载量3) 重组-DNA的筛选较为方便4) 重组-DNA分子的提取比质粒容易 三、 粘粒（cosmid)1978年构建（一）考斯质粒(粘粒，cosmid

23、) ：即含有-DNA两端cos区的质粒。cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。将此DNA片段与质粒连在一起，即cosmid,就可装载更大的外源DNA片段，同时它仍可象-DNA一样，被体外包装，以感染方式，高效的将重组DNA转入大肠杆菌考斯质粒不能形成子代病毒颗粒，更不能裂解细胞， 而是以质粒形式进行复制。由质粒和噬菌体cos位点构建而成，同时具备二者的特点： 质粒ori-环状复制 单一酶切位点 选择标记 Cos位点体外包装 构建DNA文库，容量为2945kb（二） 考斯质粒的

24、优越性1) 能象-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞2) 容量大，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该考斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA3) 由于携带质粒的选择标记，便于筛选4) 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。以cosmid为载体克隆DNA的技术路线柯斯质粒pHC79系列由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成全长4.3kbFormationof a cosmidcloneDigestionLigationC) Packaging and infectLigation to cleaved cosmid vector molecul

25、es can produce vector-target concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences. 四、 M13噬菌体载体Bacterophage M13 M13噬菌体：E.coli的丝状噬菌体 闭环正链ssDNA，6.4kbM13 生殖周期向胞外分泌单链DNARF DNAM13噬菌体载体的构建： M13-DNA上几乎没有非必需区域，因而载体的构建主要是插入标记基因如，lacZ、多克隆位点，消除多余的酶切位点。Blue-white selectionM13载体系列 M13

26、 DNA 上 引 入 lacZ 基 因 M13mp1， 可以通过插入失活鉴定重组噬菌斑。 M13mp1载体通过体外定点突变, 在基因的起始端，获得含有6碱基的序列GCATTC (EcoRI位点) M13mp2。 合成短的多聚核苷酸(polylinker),插入到M13mp2的EcoRI位点上,就将限制性内切酶位点引入到lacZ基因 M13mp7。M13噬菌体载体：用于制备单链DNA、测序M13克隆载体分子结构图五、噬菌粒载体噬菌粒载体由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制

27、起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。常用的噬菌粒载体pUC118和pUC1191. 具有较小分子量，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作； 2. 编码一个ampr基因作为选择记号，便于转化子的选择； 3. 拷贝数含量高，每个寄主可高达500个； 4. 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；5. lacZ基因插入失活，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；6. lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；7. 含有质粒的复制起点，在没有辅

28、助噬菌体的情况下， 克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子8. 带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；9. 在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的， 于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；10. 可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。pBluescript噬菌粒载体基本结构： 1. 在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指

29、导外源基因的转录活动； 2. 同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下， 可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的 3D.N A ；编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子记号； 4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。用于体外转录T7T3六、 人工染色体克隆大片段DNA1、真核生物染色体中的关键部位（复制必需区） 着丝粒(centromere,CEN):、 端粒(telomere,TEL)：保护染色体、维持染色体复制 自 主 复 制 序 列 (autonomously replication sequence，ARS)：复制起始位点2、人工染色体：以真核生物的CEN、TEL、ARS 为骨架，可携带插入的外源基因进行复制，即为人工染色体3、种类：酵母人工染色体（ye