2014核酸的生物合成12

1、中心法则, 复制 转录 翻译,第十一章 DNA的生物合成,第一节 DNA的生物合成 第二节 DNA的损伤和修复 第三节 DNA重组 第四节 重组DNA技术,美国科学家马修.梅塞尔(Matthew Keelson),福兰克林.斯塔尔(Franklin Stahl),第一节 DNA的生物合成, 实验证据: 1958年 Meselson and Stahl 将E.coli在15NH4Cl为惟一N源的培养基中15代，再转到14NH4Cl培养基中培养。,结论？,半保留复制 每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的。,一、DNA合成的方向5 3,半不连续复制,二、 参与DNA复制的酶和

2、蛋白质因子,除DNA 聚合酶外，还有引物酶，解旋酶，拓扑异构酶，单链DNA 结合蛋白和DNA 连接酶等参与。,1. 解旋酶（helicase）,DnaB和后随链模板结合，沿 5 3移动 Rep 和先导链模版结合，沿 3 5移动,功能： 使解旋后的DNA保持单链，不降解。,2、 单链DNA 结合蛋白(SSB),3. 引物酶与引发体,引物酶（primase）: 催化合成一小段与DNA模板互补的RNA作为引物。引物酶是一个单体多肽。 引发体（Primosome）:引物酶本身没有 活性，与其他蛋白质（DnaB、DnaC、DnaT、PriA、PriB、PriC等）组成的有活性的复合体，称引发体。在特定位

3、置形成引发体的关键是priA具有将SSB从单链DNA上替代下来的功能。,功能: DNA链延伸的主要 DNA聚合酶。 多酶复合体（10亚基）。,4. DNA聚合酶 III,滑动钳蛋白,滑动钳装载复合物,核心酶,DNA聚合酶III具有5 3聚合酶和3 5外切酶 活性（校正错配）,核心酶组装,滑动钳,增加核心酶的二聚体化,帮助滑动钳蛋白夹住DNA模版,5. DNA聚合酶 I,功能：DNA修复和RNA引物的去除。 Klenow 片断（68KD）： 具有5 3聚合酶和3 5外切酶活性 小片段（35kD）：具有5 3外切酶 活性 ？,Klenow 片断的结构,6. DNA聚合酶II、IV和V,IV和V,

4、1999 年发现。 除知道 II、IV 和 V 参与DNA修复外,功能不完全清楚。,在原核生物中， DNA 聚合酶是主要的复制酶。 DNA 聚合酶的主要作用是修复作用，在DNA复制中切除RNA 引物，并合成一段新的DNA片段填补缺口。 DNA 聚合酶主要作用是小缺口修复， 具有5 3聚合酶和3 5外切酶活性。,提问：为什么DNA复制需要先合成RNA引物？,1, 有助于减少DNA复制起始处的突变。 2，DNA聚合酶只能在已存在的3-OH上添加核苷酸，却不能合成第一个核苷酸。,7. DNA连接酶 (ligase),功能：催化两条DNA 片段共价连接，在DNA复制、修复、重组中都起重要作用。 真核生

5、物由ATP提供能量; 大肠杆菌由NAD 作为辅酶。,ATP或NAD+参与连接酶的连接反应,8. 拓扑异构酶（topoisomerase）,拓扑异构酶 I 或称 蛋白:,拓扑异构酶 I 或称 蛋白: 瞬时打断双螺旋中的一条链,瞬时断裂的链绕完整的链旋转，然后再将断口重新连接。 反应无需供给能量。 只能消除负超螺旋，对正超螺旋无作用，每次作用改变的L值为+1。, 拓扑异构酶 II, 拓扑异构酶 II ： 又称旋转酶（gyrase）， 可瞬时打断 DNA的两条链 , 然后再将断口重新连接。 需要ATP供能。 DNA复制时引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。每次作用改变的L值为-2。,三、原

6、核生物DNA的复制过程,起始 延伸 终止,复制叉和复制起点（Origin）,复制叉（replication fork）： DNA分子上正在复制的部位同时进行解链与合成，该部位称复制叉。,（一）、DNA复制起始,复制的起始包括DNA复制起点双链解开和RNA引物的合成。,1、DnaA蛋白与四个9bp重复序列结合，然后，2040个DnaA蛋白结合，形成起始复合体，促使双链DNA弯曲。,2、DNA双链在临近的3个富含AT的13bp序列处分离， DnaB（解旋酶）在DnaC（解旋酶安装蛋白）的帮助下结合于解链区，DnaB沿着解链方向移动，并逐步替换DnaA。,3、单链DNA结合蛋白（SSB）结合在单链区

7、，防止重新成单链或者降解。 DNA拓扑异构酶消除拓扑张力， 每个DnaB召集一个引物酶，形成引发体，合成一段RNA引物。,（二） 、DNA复制延伸, 环形DNA复制时形成 眼状结构（结构）,（三）、 DNA复制终止,两个复制叉在终止区停止复制，每个复制叉必须越过另一个复制叉的终止位点。,大肠杆菌复制的终止,Tus蛋白和Ter位点结合，抑制解旋酶活性，促使复制终止。,四、真核生物DNA复制,基本机制与原核生物一致： 半保留复制 半不连续复制 合成方向为53 具有35校对活性 需要相似的酶,差别： 1 、真核生物复制是多起点 ，冈崎片段长100200核甘酸，全部染色体复制完之前，各个起始点不能再起

8、始。 原核生物为单一起点，冈崎片段长10002000核甘酸，快速生长的原核细胞中，复制起始点上可以再起始。,2. 真核生物DNA复制由聚合酶、共同完成,3. 真核生物引物酶与聚合酶相连， 原核中引物酶 与解旋酶相连。,4.在滞后链成熟过程中，切除真核生物冈崎片断RNA引物的是RNaseH和FEN1，而原核为pol I。,PCNA proliferating cell nuclear antigen：与DNA聚合酶共同作用,功能类似滑动钳。 FEN-1 FEN-1 nuclease：与RNAase H共同作用,切除RNA引物。 RP-A replication protein A：作用与SSB相

9、似。,小结,半保留复制？ 半不连续复制？,大肠杆菌DNA聚合酶,I 主要修复酶（哪几种活性？） II 次要修复酶 III 复制酶（哪几种活性？） IV SOS修复 V SOS修复,五、 逆转录 （revease transcription）,以RNA为模板合成DNA的过程，由逆转录酶（reverse transcriptase）催化。 1970，Temin等首次在鸟类的劳氏肉瘤病毒上发现。,逆转录病毒的生活周期,RNA,衣壳,被膜,逆转录酶,转录,转译,整合入宿主细胞染色体DNA,进入细胞,丢失被膜,丢失衣壳,逆转录,RNA,RNA,cDNA,衣壳蛋白,被膜蛋白,逆转录酶,提问：有天生不会感染

10、HIV的人吗？,研究表明：HIV在进入宿主细胞需要宿主细胞的帮助，即CD4-T淋巴细胞的CD4受体和CCR5辅助受体。 CCR5基因突变后，变成一个小分子，不再定位在细胞膜上。对HIV有抗性。 约20%的白种人有这种突变，而黑色人种和黄色人种少有这种突变。,六、端粒telomere，生命时钟,端粒DNA主要功能有： 第一，保护染色体不被核酸酶降解； 第二，防止染色体相互融合； 第三，为端粒酶提供底物，解决DNA复制的末端隐缩，保证染色体的完全复制。,端粒有许多串联重复序列组成，一条链富含GT（较长），另一条富含CA（较短），末端成环。封闭染色体末端。,原生动物四膜虫端粒的重复单位为TTGGGG 哺乳类和其他脊椎动物的端粒为TTAGGG，串联重复5003000次，序列长度在2kb到20kb之间不等。,端粒酶（telomerase）,端粒酶在正常人体生殖细胞中有活性，维持端粒长度。 端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，体细胞端粒不断缩短。 在肿瘤中端粒酶被重新激活，可能参与恶性转化。,端粒酶（Telomerase）是一种逆转录酶，由蛋白质和RNA两部分组成，功能是延长端粒。,2009年诺贝尔生理学或医学奖授予伊丽莎白布莱克本、卡罗尔格雷德和杰克绍斯塔克，以表彰他们发现了端粒和端粒酶保护染色体的机理。,提问：原核生物怎样保持DNA复制的忠实性