实验三-红曲色素的提取

1、实验三、红曲发酵及红曲色素 的提取,1,2,3,红曲霉菌,红曲,背景简介：,红曲色素,红曲霉菌 红曲霉菌是一种对人类有益的真菌，红曲霉菌能使大米发酵制成红曲米。 红曲霉菌菌丝具有横隔、多核、分枝较多且不规律。 由红曲霉接种于大米发酵得到的红曲是我国古代的一大发明，称为丹曲，至今已有1000多年的历史，很早就应用于食品着色、食品发酵以及中医中药。,红曲菌是腐生真菌，生长的最适pH为3.5-5，能耐pH3.5，尤嗜乳酸。 生长温度为26-42，最适温度为32-35；能耐10%乙醇。 能合成生物素、泛酸、尼克酸硫胺素、核黄素等。还能产生色素、乙醇、琥珀酸及少量乳酸、醋酸等。红曲菌的液化型-淀粉酶的活

2、性弱，而糖化型-淀粉酶的活性较强，故可用来生产红色麦芽糖。红曲菌的蛋白酶的活性较高。 红曲霉可代谢生成多种酶类，有葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶、蛋白水解酶、酯化酶等。,特性：,红曲,红曲又名丹曲、赤曲、红曲米，是以籼米为原料，经红曲霉菌液体深层发酵精致而成，是一种纯天然、安全性高、有益于人体健康的食品添加剂。而且本品色泽鲜艳、色调纯正是天然绿色食品理想的着色剂。 它应用范围广泛，包括食品类（肉制品、果汁、色酒、果酱、饮料、糖果、糕点、酱油、保健醋等）；药品类（药品着色剂、功能性保健品）；化妆品类。,红曲色素 红曲色素是一种由红曲霉属的丝状真菌经发酵而成的优质的天然食用色素，是红曲霉的次级代谢产物。

3、 红曲色素，红曲色素分为黄色素、橙色素和紫红色素。商品名叫红曲红，是以大米、大豆为主要原料，经红曲霉菌液体发酵培养、提取、浓缩、精制而成，或者是以红曲米为原料，经萃取、浓缩、精制而成的天然红色色素。,红曲色素,物理性质：红曲色素呈深紫红色粉末，略带异臭，熔点为165192。 化学性质：红曲色素中的脂溶性色素均能溶于乙醇等有机溶剂。常用的溶剂是乙醇和醋酸，红曲色素含量低时其溶液呈鲜红色，含量高时呈带黑褐色并伴有荧光产生。对蛋白质的着色性能极好，一旦染着，虽经水洗，亦不掉色。,红曲色素的特性：,1 热稳定性 经研究证明，红曲色素的热稳定性较好，优于其他合成色素，在天然色素中其耐热性能也属优良。 2

4、 光稳定性 红曲色素的醇溶液受紫外线的影响较小，但日光能使色度降低。通过对红曲色素中红、橙、黄3类色素光稳定性实验分析发现，红曲色素中红、橙、黄3类色素间光稳定性差别很大，黄色素的光稳定性最强，其次为红色素，橙色素对光最不稳定。 3 对其他物质的稳定性质 实践证明，红曲色素不受常见金属离子与氧化剂和还原剂的影响。 4 抗菌性 对食品中 54 种易污染的微生物进行抑菌试验证明：红曲色素对肉毒梭状芽胞杆菌，蜡状芽胞杆菌、霉状杆菌、枯草杆菌、金黄葡萄球菌、荧光假单胞杆菌有较强的抑制作用。,一、实验目的,1、了解红曲菌液体菌种的制备方法, 为红曲发酵实验准备液体种子。 2、了解固体发酵的工艺过程 ,

5、在实验室中小规模制备红曲。 3、熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素色价的测定方法。,1,2,3,红曲液体菌种的制备,红曲固体发酵,项目,红曲色素的提取及红曲色价测定,红曲液体菌种的制备,一、实验原理 红曲霉菌是一种好氧性微生物, 除了能进行固体浅盘培养外, 还可以用液体摇瓶培养的方法来获得种子。 液体菌种生产具有纯度高、活力强、繁殖快的特点，接种到固体培养料内有流动性好、萌发点多，菌丝生长迅速等特种点。液体菌种应用于生产与固体菌种相比有以下优点：菌种生产周期短；接种后，萌发点多；接种方便、成本低；适宜工厂化生产。液体菌种为固态发酵的集约化、标准化生产创造了更好的条件。,二、实验器

6、材与试剂 1菌种：两种红曲菌种 2玉米面液体培养基（g/L）：蛋白胨 20；玉米面 20；酵母浸粉 10；硫酸镁0.5；磷酸氢二钾 1；硫酸亚铁 0.1；pH 6.0。 3两个500ML三角瓶，酒精灯，接种针，恒温摇床, 超净工作台, 高压蒸汽灭菌锅等。,三、实验步骤 1.配制玉米面液体培养基。500mL 三角瓶中装玉米面液体培养基 150mL, 包扎后 0.lMPa 灭菌 20 分钟。,2.玉米面液体培养基灭菌冷却后，每瓶中接入 1/4 支红曲斜面菌苔 ( 注意无菌操作 ) 。,3.接种后置30恒温摇床中 180 rpm 摇瓶培养 3天。,红曲固体发酵,一、实验原理 红曲霉菌作为红曲的生产菌

7、, 以其可产生大量天然色素而著称。红曲的应用主要有三方面：食品色素、药物和发酵食品。 红曲的主要成分 1）红曲色素：黄色素、橙色素和紫红色素 2）活性酶 3）洛伐他汀（日本发现） 4）抑菌物质：桔霉素(Citrinin)等 国内红曲的生产现在普遍采用固态发酵的方法。,红曲固体发酵,红曲固态发酵,固态发酵的定义：微生物在几乎没有游离可流动水的培养基上的生长过程及生物反应过程。,影响红曲发酵的因素,（1）菌种：应选择生长快、适应性强、产红色素明显的菌株； （2）原料：一般选用无黏性的梗米或籼米，其淀粉含量高、营养丰富，且可吸收适量水分。米的含水量对发酵影响很大，起始水分含量低，红曲色素易生成；水分

8、含量高，会抑制色素合成。一般米中含水量以25 %30 %为宜； （3）补水：红曲霉在生长繁殖过程中，需要补充适量水分，尤其在生长旺盛期补水显得更为重要； （4）湿度：空气相对湿度关系到水分的蒸发，对发酵的影响也很大，一般RH控制在85 %以上； （5）温度：能在2037范围内生长，通常冷却至30左右即可接种，采用30发酵； （6）通气：红曲霉是一种好氧性微生物，因此培养过程中要注意保持良好的通气。,1. 碳氮源和生长素 红曲霉能利用多种糖类生长，一般说来，淀粉、糊精、葡萄糖等都是良好的碳源，而在对麦芽糖、蔗糖等的利用上各菌株间差异很大。另外，适于红曲霉生长的碳源并不一定有利于色素的产生，如红曲

9、霉Monascus sp.3.973菌株用合成培养基（糖5，NaNO3 1，KH2PO4 0.5%，MgSO47H2O 0.25，FeCl3微量，150 mL三角瓶内装25 mL培养基）培养时，若以麦芽糖为碳源，可得生物量（干重）0.1 g，稀释100倍后的发酵液其吸光度（A505nm）为0.860；而以木糖为碳源时，生物量仅0.04 g，但是1%发酵液的吸光度（A505nm）可达1.850，说明生长与色素的产生之间不呈正相关。 就氮源而言，NaNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4和蛋白胨等都是红曲霉生长的良好氮源，然而菌体生长与色素生成之间也不呈正相关。泛酸钙、对氨基苯甲酸、维生素B6、

10、肌醇等含氮物质具有促进某些菌株生长及色素生成的作用。,补充点：培养条件对菌体生长及红曲色素形成的影响,培养条件对菌体生长及红曲色素形成的影响,2. 温度和pH 虽然不同的红曲霉菌株其最适生长温度和最适生长pH有所不同，但大多数菌株的适温为3035，25以下或40以上生长缓慢。最适pH为3.05.0，pH 3.0以下生长缓慢，pH5.0以上则不适于产生色素。 3. 无机盐类 高浓度的CoCl2（104）、CuCl2（106）和ZnCl2（103）对大多数红曲霉株的生长有抑制作用，低浓度的CoCl2（105）、CuCl2（107）和ZnCl2（105）可促进色素生成。,二、实验器材与试剂 1、制曲

11、原料 : 优质籼米。 2、蒸锅、三角瓶、玻璃棒、移液管（灭菌），超净工作台。,工艺流程：,菌种选育斜面培养摇瓶培养液体种子发酵 大米清理浸泡清洗蒸饭冷却接种固体培养 干燥粉碎红曲色素提取,三、实验步骤 1 浸米:取1/3袋左右的大米，25 以上浸米约20h, 大米吸收水分约在 28%30% 。 2蒸米: 将浸好的米用清水淋去米浆水,沥干, 即可蒸米。上汽火力要强,加水40%，121，蒸30分钟，待全部圆气以后，饭粒呈玉色, 粒粒疏松,不结团块。 3摊凉接种: 将蒸熟的曲料倒在超净工作台上迅速打碎团块, 摊平冷却到 3032 。每组准备好500ml三角瓶装5-10厘米左右米饭。然后在无菌操作台上

12、接种，接种量2%10%，接种前用具消毒灭菌，在酒精灯火焰上方操作接种。充分翻拌混合均匀,操作要迅速,以减少杂菌污染。,4发酵培养: 接好种的三角瓶在恒温恒湿生长培养箱中，30 35培养58d。 每天翻曲一次，观察到曲粒表面略有干皮、少数曲粒略有微红斑点等现象时即可“吃水”，使曲粒吸收一定水分, 以利菌丝逐渐向内生长。 吃水方法: 一边拌曲，一边向曲盘中喷洒无菌水, 使曲粒表面润湿并微有发胀。培养3天后米粒逐渐成红色。观察记录色素产生的过程。培养5-7天后，固态发酵结束的红曲置于鼓风干燥箱内50-60鼓风干燥。,5成品质量检查 外观检查 : 曲粒表层光滑紫红, 曲粒中心呈玉色, 不得有空心和红心

13、。曲粒断面菌丝均匀，具有红曲特有的曲香, 不得有酸气等不正常气味。 生物与理化项目检查: 水分12%以下 , 容量(l00mL)44.546.5g, 淀粉含量%, 无细菌和其他霉菌污染。,四、注意事项 1、浸米时用醋酸调PH至5.0-5.5左右，有利于发酵产品色价的提高。 2、清洗时要至无混浊。 3、蒸饭时，要熟过心，但不能结团。 4、接种时注意无菌操作。 5、注意控制过程中的温度。,一、实验原理 大米经红曲菌固体发酵后产生了一系列红曲菌的代谢产物, 但这些产物的量非常少, 大米仍占固体发酵产物的绝大部分体积, 为了降低运输成本, 常常要对红曲菌的代谢产物进行提取和浓缩。红曲的代谢产物中既有水

14、溶性组分, 也有脂溶性组分, 因此可用 80% 的丙酮(丙酮:水 =80：20)抽提。用 HCl 或 NaOH 处理可以将其中的酸溶性组分、碱溶性组分和中性组分分开。,红曲色素的提取及红曲色价测定,一、实验原理 选择溶剂一般要注意以下四点： 溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质溶解度要小，或反之。 溶剂不能与天然药物成分产生化学反应，即使反应亦属于可逆性的。 溶剂要经济易得，并具有一定的安全性。 沸点宜适中，便于回收反复使用。 红色素能溶于80% 的乙醇中，可通过萃取从米粒中提取出来, 红曲色素在505nm 处有最大的吸收峰, 可用分光光度计来测定。,二、实验器材与试剂 1、旋转蒸发仪, 分液漏

15、斗，分光光度计,水浴锅,量筒等。 2、酸乙酯,丙酮，80%乙醇等,三.实验步骤,1,2,红曲色素的提取,红曲色价测定,一般提取方法：,萃取法 组织培养法 粉碎法 压榨法 酶反应法 微生物发酵法 人工合成法,红曲色素的提取,红曲色素的提取,具体步骤：,1、取 200g 固体发酵之红曲, 在植物粉碎机中将其粉碎；,2、将红曲粉放于 500mL 三角瓶中, 加入提取液(丙酮 : 水 =80:20)200-300mL；,3、室温下摇动10-15min左右，过滤； 4、在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮( 尚有水分，60 )；,5、用 l mol/L HCl 调残留液(约 l00mL)的pH至3.0, 加至分液

16、漏斗中；加入150ml的醋酸乙酯（EtOAc)分次抽提。,图一：红曲代谢产物分离工艺流程图,第一次,第二次,第三次,第四次,分工：,一组：配制提取液（丙酮：水=80：20）， 2000ml； 二组：配制1mol/L HCl， 1000ml； 三组：配制2mol/L NaOH, 500ml; 四组：配制Na2CO3(pH=9), 500ml;,具体方法：,红曲色价测定：,1、称取红曲米样品 0.5g, 放入带有刻度的 lO mL 具塞试管中； 2、加入 80%的乙醇 8 mL, 摇匀,60水浴保温萃取0.5h； 3、取出冷却, 用普通定性滤纸过滤入lO mL 量筒中, 用 80% 乙醇洗涤残渣 2