肿瘤坏死因子.ppt

1、1,肿瘤坏死因子,谢静,2,近年来，人们一直都在寻找攻克恶性肿瘤的方法，但到目前为止仍然没有十分有效的治疗手段。所以,寻找具有生物活性的细胞毒性分子诱导肿瘤细胞凋亡逐渐成为肿瘤生物治疗领域关注的焦点。 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是迄今发现的直接杀伤恶性肿瘤作用最强的生物活性因子，能特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显的毒性作用，因而受到人们的普遍重视。,3,目前普遍认为，TNF最早是1975年由Carswell发现的。Carswell在研究中观察到，经卡介苗致敏的小鼠被注射大肠杆菌内毒素后，血清中出现一种物质，该物质在体内可以使移植肿瘤发生出血、坏死，遂

2、将该物质命名为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF),4,自Carswell发现TNF后，许多学者进行的其他研究均观察到TNF在体外和体内对多种肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。1984年Pennica等首次克隆了人TNF-的cDNA，并在大肠杆菌中表达成功。 20世纪80年代末，西方国家就已批准了人TNF治疗恶性肿瘤的临床试验，但因毒副作用太强而未能进行下去。,5,随着对TNF结构和作用机制的深入研究，一些高效、低毒的TNF变构体不断涌现，TNF的临床研究又有了新的进展。下面简单介绍一下TNF。 TNF的结构与功能 TNF的生物学活性 TNF抗肿瘤作用的机制 TNF的

3、基因疗法,6,TNF的结构与功能,把巨噬细胞产生的tnf命名为tnf- ，把t淋巴细胞产生的淋巴毒（lymphotoxin,lt)命名为tnf-。tnf-又称恶质素。,7,tnf-是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，lps是较强的刺激剂。ifn-、m-csf、gm-csf对单核细胞/巨噬细胞产生tnf-有刺激作用，而pge则有抑制作用。前单核细胞系u937、前髓细胞系hl-60在pma刺激下可产生较高水平的tnf-。t淋巴细胞、t细胞杂交瘤、t淋巴样细胞系以nk细胞等在pma刺激下也可分泌tnf-。sac、pma、抗igm可刺激正常b细胞产生tnf-。此外，中性粒细胞、lak、星状细

4、胞、内皮细胞、平滑肌细胞亦可产生tnf-。,8,tnf-是一种淋巴因子，抗原和丝裂原均可刺激t淋巴细胞分泌tnf-。pma刺激rpmi1788b淋巴母细胞可分泌高水平tnf-。,9,人的tnf-基因长约2.76kb，小鼠为2.78kb，结构非常相似，均由4个外显子和3个内含子组成，与mhc基因群密切连锁，分别定位于第6对和第17对染色体上。 人 和小鼠tnf-基因分别定位于第6和第17号染色体。hutnf-分子由205个氨基酸残基组成，含34氨基酸残基的信号肽，成熟型hu tnf-分子为171个氨基酸残基，分子量25kda。,10,肿瘤坏死因子的作用,借助机体免疫功能，对同一肿瘤产生直接和间接

5、双重活性的抗癌效应，并使营养血管出血坏死。 刺激成纤维细胞(修复 )增殖。 抑制脂蛋白的脂质活性。 增进凝血因子及组织因子(血液凝固 )的活性。,11,诱导产生IL-2(白介素2，参与抗肿瘤效应)及IL-6 增强中性粒细胞(趋化、吞噬和杀菌 )对血管内皮的黏附性。 产生菌溶刺激因子等。 在体外对人类肿瘤细胞(如鼻咽癌、子宫癌、白血病等)有直接抑制增殖作用。在体内可引起肿瘤坏死、瘤体缩小以致消失。,12,TNF的生物学活性,TNF是一种真正的多效因子，具有多种生物学效应。它可直接作用于T细胞、B细胞、NK细胞等效应细胞， 在细胞水平上发挥作用。 与受体结合，引起细胞破坏、死亡 损伤内皮细胞，激活

6、凝血系统 引起机体发热 促进细胞的增殖和分化，调节机体免疫功能 抑制新骨生成、刺激骨吸收 激活嗜中性粒细胞和巨噬细胞,13,TNF抗肿瘤作用的机制,通过TNF受体介导的对肿瘤细胞的直接杀伤作用 抑制细胞生长和诱导凋亡 通过损伤肿瘤的血供系统而导致肿瘤的坏死 通过引起肿瘤局部的炎症反应和机体的免疫系统发挥抗肿瘤作用 逆转肿瘤细胞的多药耐药，增加对化疗药物的敏感性,14,TNF的基因疗法,TNF基因导入免疫细胞以增强其免疫杀伤效应 1993年首次将TNF基因导入T 细胞，与未转染的T 细胞比较，转染细胞产生大量TNF，但与相同条件下转染的肿瘤细胞相比产量很低。随后，Tashiro等将TNF基因导入

7、LAK细胞，使LAK细胞膜表面TNF呈阳性，分泌量增加，细胞毒活性增强。,15,将TNF基因导入肿瘤细胞以诱导机体免疫系统产生更有效的免疫应答 有实验证实局部的TNF高浓度可在宿主没有毒性反应的情况下导致肿瘤消退。1992年Rosenberg等用TNF基因转染自身肿瘤细胞，然后收集引流部位的淋巴细胞，经体外加IL-2培养扩增后回输给病人。期望通过遗传工程技术使肿瘤细胞额外产生TNF，刺激局部的淋巴细胞和趋化全身其它部位的淋巴细胞到达肿瘤部位，增强免疫杀伤作用，但临床效果不佳。,16,TNF突变型,由于多数学者认为TNF的细胞毒活性是由TNFR-p55介导的，因此研究者们主要致力于改建能选择性地

8、与TNFR-p55结合的TNF突变型。 已报道有些TNF突变型能选择性地结合TNFR-p55,而与TNFR-p75的亲合力很低。人们希望这些TNF突变型用于临床治疗时能突出其抗瘤效应，而同时尽可能地降低其毒副作用。,17,受体选择性TNF突变型 TNF的生物学活性是通过TNFR介导的。当TNF与TNFR结合后即内化并降解，产生一系列细胞内信号，导致不同的生物学活性。虽然目前对两类TNFR是否有分工及如何分工尚无一致意见，但二者细胞内结构差别很大，几乎可以肯定它们在细胞内信号 传递上存在差异。由于多数学者认为TNF的细胞毒活性是由TNFR-p55介导的，因此研究者们主要致力于改建能选择性地与TN

9、FR-p55结合的TNF突变型。已报道有些TNF突变型能选择性地结合TNFR-p55,而与TNFR-p75的亲合力很低。人们希望这些TNF突变型用于临床治疗时能突出其抗瘤效应，而同尽可能地降低其毒副作用。,18,不分泌性 TNF突变型,Kriegle等首先发现，人T N F-a有两种形式，即26k D膜结合型及17kD分泌型。认为这两种形式的人T N F-a均有细胞毒活性。此后，另一些学者发现膜结合型TNF在杀伤TNF敏感的靶细胞中起主要作用。1990年，Perze等通过缺失突变人T N F-a得到一个仅表达在细胞膜表面、不分泌的TNF突变型。他们用这种不分泌的 TNF突变型基因转染NIH3T

10、3细胞发现，这种不分泌的TNF突变型能杀伤肿瘤细胞及 病毒感染细胞，且能将其作用局限在靶细胞附近而不引起TNF分泌所导致的全身性毒副作用。因此人们设想，如果将这种TNF突变型用于基因治疗，既可增强抗瘤效应，又可以克服TNF分泌量过高引起的毒副作用，有可能解决野生型TNF基因用于基因治疗中所存在的一些问题。,19,TRAIL及其受体,肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)或称凋亡素2配体(Apo2 ligand,Apo-2L), 是近几年发现的一个可诱导肿瘤细胞凋亡的TNF家族成员。,20,TRAIL最大的优点是

11、它可以选择性诱导肿瘤细胞凋亡,但对正常细胞没有毒副作用。因此,TRAIL已经成为许多研究的热点,并有可能成为新一代的抗肿瘤药物。,21,TRAIL的结构特点,人TRAIL分子属型跨膜蛋白,包括胞浆区(14aa)、跨膜区(26aa)和胞膜外区(241aa)。C端(细胞外区域)保守性强,能形成几个折叠,再形成典型的夹心结构,进而形成同源三聚体的亚结构;N端(细胞内区域)没有信号肽序列,其发挥功能的部位主要位于胞外区。,22,TRAIL受体,TRAIL是通过与其细胞膜受体结合发挥诱导凋亡作用的,目前已经发现了5种TRAIL受体,它们都可以与TRAIL发生特异性结合,并且不与其它细胞毒配体结合。,23

12、,死亡受体,TRAIL-R1和TRAIL-R2均属于TNFR(TNFreceptor)基因超家族成员。它们分别具有一段死亡结构域(death domain,简称DD),与TRAIL结合后可诱导肿瘤细胞凋亡,故又被称作死亡受体。TRAIL-R1也称死亡受体4(death receptor-4,DR4), DR4属型跨膜蛋白，它的胞外区有两个半胱氨酸富集区(cysteine-rich domain, CRD),胞内有一段由70个氨基酸组成的死亡结构域。,24,TRAIL-R2也称死亡受体5(DR5), DR5也属型跨膜蛋白, 它的胞外和胞内区也分别含有两个半胱氨酸富集区及一段死亡结构域。 DR5过

13、表达可引起多种细胞发生凋亡,例如: Jurkat为TRAIL敏感细胞株,细胞表面DR5高水平表达,当用DR5的单克隆抗体(DR5mAb)与Jurkat细胞表面的DR5作用后,TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎完全被阻断。,25,诱骗受体,TRAIL-R3和TRAIL-R4因为没有死亡结构域,或死亡结构域不完整,虽然可以与TRAIL结合,但不能传递死亡信号,无法诱导细胞凋亡,故被称为诱骗受体。这类受体可能在正常细胞抵制TRAIL的诱导凋亡作用中扮演重要角色。,26,TRAIL-R3也称诱骗受体-1 ( decoy receptor-1,DcR1)它是一个糖基磷脂酰肌醇(glycophos

14、-phatidyl inosito,l GPI)锚定的细胞表面蛋白。DcR1与TRAIL亲和力较高,它有5个糖基化位点,去糖基化可以增强DcR1与TRAIL的亲和力。它在胞外区含有一段与死亡受体同源性很高的半胱氨酸富集区,不同点在于它没有胞内死亡结构域,因此可以与TRAIL结合但不能传递死亡信号。,27,TRAIL-R4也称DcR2,它是一个由386氨基酸编码的型跨膜蛋白, 与死亡受体相比,DcR2的C端缺少52个氨基酸,即胞内有一段不完整的死亡结构域,故也不能传递死亡信号。,28,TRAIL的作用机制,TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的机制TRAIL诱导细胞凋亡主要有两个途径: (1)半胱天冬酶(

15、caspase)和死亡受体相关的细胞凋亡途径; (2)线粒体相关的细胞凋亡信号途径。TRAIL与其他TNF家族成员一样,可以诱导多种肿瘤细胞凋亡,而且对抑癌基因p53突变造成的对放疗、化疗不敏感的肿瘤细胞也有较好的诱导凋亡的作用。,29,半胱天冬酶(caspase)和死亡受体相关的细胞凋亡途径,TRAIL三聚体能诱发死亡受体DR4和DR5三聚体化。死亡受体一端通过胞外区的半胱氨酸富集区与TRAIL结合并被活化,另一端通过胞内区的死亡结构域与接头蛋白(adaptor pro-tein)C端的死亡结构域结合,接头蛋白再以其N端死亡效应域(DED)与半胱天冬蛋白酶原(pro-caspase)在末端的

16、局部募集并串连结合,形成TRAIL-死亡受体-接头蛋白-pro-caspase死亡诱导信号复合物(DISC),30,促使pro-caspase自身水解成为有活性的caspase-8。 Caspase-8可以激活caspase级联反应,进一步募集和激活caspase家族中的下游信号传导酶,直至最终激活效应酶caspase-3,诱导细胞凋亡。,31,线粒体相关的细胞凋亡信号途径,在线粒体途径中, caspase-8被激活后通过线粒体释放细胞色素C(Cytochrome C)来激活caspase-3诱导细胞发生凋亡。具体途径是: DISC激活caspase-8后, caspase-8催化Bcl-2家

17、族蛋白Bid(Bcl-2 inhibi-tory BH3-domain)降解生成截短的Bid( tBid), tBid导致线粒体释放Cytochrome C与Apaf-1(Apoptosis protease-activator factor-1)和dATP共同促使procaspase-9自身催化形成有活性的caspase-9,进而活化效应蛋白caspase-3,最终导致细胞凋亡。,32,此外，死亡受体与配体结合后，促使磷脂酶C水解卵磷脂生成甘油二脂，甘油二脂使蛋白激酶C-6活化，蛋白激酶C-6能够使磷脂爬行酶-3（Phospholipid scramblases 3 PLS 3 ）磷酸化，之

18、后促进线粒体膜上磷脂的双向运动，与Bid(Bcl-2家族蛋白)相互作用，导致细胞色素C的释放，促使procaspase-9自身催化形成有活性的caspase-9,进而活化效应蛋caspase-3,最终导致细胞凋亡。,33,线粒体相关的细胞凋亡信号途径,半胱天冬酶(caspase)相关的细胞凋亡途径,34,正常细胞或肿瘤细胞抗TRAIL诱导凋亡的机制,TRAIL最大的优点是它可以选择性诱导肿瘤细胞凋亡,但对正常细胞没有毒副作用。虽然DR4和DR5在肿瘤细胞和正常细胞中的表达水平相当,但两种细胞对TRAIL的敏感性确相差甚远,这就不能合理解释正常细胞存在TRAIL抗性的原因,直至人们发现了TRAI

19、L的诱骗受体才解释了其中部分原因。,35,DcR1和DcR2广泛的表达于人体各正常组织,但在变异细胞中低表达甚至不表达,它们与死亡受体竞争性结合TRAIL,由于没有死亡结构域或死亡结构域不完全,胞外区虽然可以同TRAIL特异性结合,但胞内区不能通过DD同接头蛋白结合激活caspase-8,不能通过caspase的级联效应激活效应蛋白caspase-3,最终无法诱导细胞凋亡。肿瘤细胞由于缺乏诱骗受体的保护而易被TRAIL杀伤。,36,近年来许多研究显示,除了诱骗受体对细胞的保护作用外,TRAIL还能通过激活Akt途径核因子B(NFB)、蛋白激酶C(PKC)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成

20、员等多种机制调节TRAIL的凋亡诱导活性。此外,死亡受体核苷酸的突变和OPG的竞争性作用也可能造成细胞对TRAIL的抗性。,37,TRAIL在肿瘤治疗中的应用,TRAIL因其对正常细胞没有毒副作用的优点，现已成为肿瘤治疗研究领域研究的热点。TRAIL可以诱导近2/3的肿瘤细胞系发生凋亡，对乳腺癌、肝癌、结肠癌、肾脏肿瘤和白血病细胞等均有抑制细胞生长和细胞毒效应。,38,虽然TRAIL可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，是一种较有前途的抗肿瘤药物，但是，仍存在一些对TRAIL敏感性低的肿瘤细胞,在一定程度上限制了它的应用。 近年来,人们在TRAIL与离子射线、抗真菌药、化疗药、基因毒性药和细胞因子的联合治

21、疗方面做了大量研究，并取得了比较满意的结果，使TRAIL在抗癌领域更加有效的发挥功能。研究发现，重组TRAIL与化疗药物顺铂共同使用时，二者的协同作用对卵巢癌细胞的诱导凋亡作用明显强于两者单独使用。,39,虽然人们通过大量的研究已经对TRAIL有了比较深入的了解，但具体的信号转导机制、基因调控、在健康或病体体内的确切作用等许多方面仍不十分清楚。随着对这种活性大分子的研究继续深入, TRAIL可能将是一种具有广阔临床应用前景的抗癌药物。,40,肿瘤坏死因子与疾病,应用TNF在治疗肿瘤等方面开始临床期试验，也可与IL-2治疗肿瘤，目前认为全身用药的疗效不及局部用药，后者如病灶内注射，局部浓度高且副

22、作用也较轻。近年来已采用TNF基因治疗开始对黑素瘤等肿瘤进行临床验证。值得重视的是TNF又与临床某些疾病的发生有关。 近来一些研究证实在动物实验中一些胰腺外或其他器官(如肺脏)的炎症及组织破坏的发展往往需要某些细胞因子受体的激活，表明这些细胞因子可能参与了胰腺炎多器官功能衰竭的发生发展。例如：肿瘤坏死因子(TNF-)与急性胰腺炎及多器官功能衰竭的关系,41,例如：,动物在注入TNF-后能复制出类似内毒素休克时出现的高热、心动过速、低血压和基础代谢率增高等症状。在动物实验中直接注射TNF-可引起低血压，代谢性酸中毒和血液浓缩，甚至数分钟内致实验动物死亡。将重组TNF-注入大鼠体内几分钟后发现动物

23、出现呼吸频率加快，换气过度，乳酸堆积，酸中毒，继而血压下降。 当TNF-被拮抗后，胰腺及肺等胰腺外脏器的炎症与损伤被控制，低血压被阻止，生存率提高。以抗TNF-多克隆抗体对胰腺炎大鼠进行预处理。结果发现比对照组在血淀粉酶、血钙离子、血细胞比容、血糖等各个指标上都有明显改善(P0.001)，从另一个方面证实了TNF-在急性胰腺炎的发生发展中起重要作用。,42,牛皮癣和银屑病关节炎(PsA)：目前，肿瘤坏死因子抑制剂正处于用于牛皮癣和银屑病关节炎的后期阶段的临床研究阶段。该药物种类将是银屑病关节炎市场中增长的主要驱动力。对于牛皮癣市场，该研究认为如果象预料的那样，使用抗肿瘤坏死因子治疗剂能够相当好

24、地控制皮肤症状，这些药物也将在患有银屑病关节炎的患者亚群中获得特定的立足点。,43,充血性心力衰竭：重要的临床和临床前证据证明，充血性心力衰竭与肿瘤坏死因子的生物活性的高水平有关。该研究认为抗肿瘤坏死因子药物的开发者将会进一步考虑该种药物用于充血性心力衰竭。,脓毒症：临床试验已适当地证明肿瘤坏死因子在减少死亡率方面的确切的有益的作用。,44,最新成果重组改构人肿瘤坏死因子,目前，世界上第一种重组改构人肿瘤坏死因子药物已经研制成功，改造后的这株肿瘤坏死因子与天然肿瘤坏死因子相比，毒性降低了90倍，对肿瘤细胞的杀伤活性提高100到1000倍，对肿瘤生长抑制率达到了60%以上 。这种药物适用于联合化疗对实体瘤进行治疗，无明显副作用。经过500多名肿瘤患者的临床应用，这一基因工程药物对胃癌、肠癌、肾癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤等恶性肿瘤的治疗有效率达到27.86%，尤其对非小细胞肺癌的治疗有效率达到50%。,45,肿瘤坏死因子的临床研究,感染性休克 ：目前认为革兰氏阴性杆菌或脑膜炎球菌引起的弥漫性血管内凝血、中毒性休克是由于细菌