生物技术在园艺植物育种中的应用.ppt

1、第十一章生物技术在园艺植物育种中的应用,生物技术(Biotechnology):以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与工程原理相结合进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。 生物技术是在分子生物学和细胞生物学基础上结合现代工程学的方法和原理而发展起来的一门综合性科学技术。,第一节 组织与器官培养,第二节 花药与花粉培养,第三节 原生质体培养 第四节 体细胞杂交,第五节 植物细胞突变体的离体筛选,第六节 基因工程与育种,第七节 分子标记与育种,主要内容：,植物组织培养（Plant Tissue Culture）,将植物离体器官、组织

2、或细胞等外植体，在适宜的人工培养基和无菌条件下，给予光照、温度等环境条件并培养，使其生长、增殖、发育形成小植株的方法。 狭义的组织培养仅指愈伤组织培养，广义的组织培养指各种类型的植物无菌培养技术。组织培养概念多指广义上的组织培养技术，包括胚胎培养、器官培养、组织培养(愈伤组织培养)、细胞培养、原生质体培养等。,植物特殊 倍性创造,植物 组织培养,培育植物 新品种,种苗脱毒与 快速繁殖,体细胞杂交,次生产物 生产,基础研究,第一节 组织与器官培养,组织与器官培养的类别,组织与器官培养的应用,茎尖和分生组织培养 胚培养 胚珠和子房培养 胚乳培养 离体叶的培养,组织与器官培养(tissue and

3、organ culture):,相关专业术语,细胞全能性(totipotency): 一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。 外植体(explant):用于培养的离体材料。 愈伤组织(callus):在培养过程中，从植物各种器官、组织的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。 胚状体(embryoid):由外植体或愈伤组织产生的,与正常受精发育方式类似的胚胎结构。 继代培养(subculture)：对外植体增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代培养。,组织和器官培养全过程可分四个阶段:,无菌培养物的建立,营养繁殖体的增殖,生根,植株

4、移栽,各个阶段在培养基,生长调节剂的配比和浓度, 培养方式和环境上都不同的要求.,组织和器官培养在育种中的作用,加快园艺植物新品种和良种繁殖速度 培养无病毒苗木 诱发和离体筛选突变体 进行种质资源长期保存和远距离运输 获得倍性不同的植株 克服种子发育和萌发中的障碍 克服远源杂交困难 提供育种中间材料,第二节花药与花粉培养,花药培养,花粉培养,花药培养：其外植体为植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。 花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲，它属于

5、细胞培养的范畴。,花药培养的基本程序,外植体选择外植体(花蕾)预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养,在离体培养条件下要使花药中的花粉改变其正常发育方向而形成单倍体植株，需要各种因素共同调节和控制。,外因：培养基的成分，外源激素的种类，糖的浓度,内因：主要决定于花药中花粉发育时期,培养基,花药培养常用的基本培养基： MS（Murashigc & Skoog，1962）； Nitsch (Nitsch，1969)； N6 (朱至清，1974)； B5 (Gamborg etal.，1976)。 附加成分：蔗糖, 激素。,花药培养常用的激素 细胞分裂素类： BA 6-benzyladenin

6、 KT kinetin Zeatin 生长素类： NAA naphthalene acetic acid IAA indole-3-acetic acid 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid,蔗糖:蔗糖在花药诱导培养阶段的功能主要是：提供C源；维持适宜的渗透压；抑制花药壁的分裂而促进花粉细胞分裂。,番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应 蔗糖浓度（） 2 3 4 6 10 13 17 诱导频率（） 5 10 12 18 25 45 8,花粉发育时期 四分体 小孢子 单核花粉双核花粉 最适期,花粉及小孢子培养,1取材时期的确定 四分体单核早期单核晚期双核早期双核晚

7、期三核期,小孢子,花粉粒,花药培养与小孢子培养的目的一样，为获得单倍体。单倍体(haploid):指具有配子体染色体数的孢子体 (植物个体)。 diploid 植物，其haploid即为monoploid 玉米 2n = 2x = 20 n = x = 10 柑橘 2n = 2x = 18 n = x = 9 tetraploid植物，其haploid为dihaploid 马铃薯 2n = 4x = 48 n = 2x = 24 hexaploid植物，其haploid为triploid 普通小麦 2n = 6x = 42 n = 3x = 21 octoploid植物，其haploid为te

8、traploid 草 莓 2n = 8x = 56 n = 4x = 28,单倍体在育种中有特殊的地位，其作用表现在,加倍后可迅速获得纯合型材料，缩短育种年限。 获得育种中间材料。 与诱变育种相结合可以提高诱变频率。 与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义，无籽三倍体。 作为遗传工程受体更为有效。 用于基础遗传研究的各个领域。 获得超雄植株（YY )。 可获得异源体附加系、代换系和易位系。,第三节 原生质体培养,原生质体培养和体细胞杂交的步骤 原生质体培养（Protoplast culture） 体细胞杂交（Somatic hybridization） 原生质体融合（Protopl

9、ast fusion）,一.原生质体的概念,原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。 核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。 胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。,二.原生质体的分离,基础材料准备,预处理与酶解,原生质体活力测定,原生质体收集与纯化,1.分

10、离原生质体材料的准备,无菌试管苗叶片 上胚轴和子叶 培养细胞,2. 预处理及酶解,酶,酶解,渗透压 调节剂,材料预处理 在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同。 例如龙胆试管苗的叶片只有用4低温处理，甘蔗植株必须先在黑暗条件下培养12h后分离的原生质体才能分裂。,原生质体分离常用的商品酶,酶溶剂及其渗透压 溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。,酶处理,l,3、原生质体的分离纯化,原生质体的收集和纯

11、化,飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll。 沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。,4.原生质体活力测定,目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。 FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。 伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。,FDA荧光染色法( 双醋酸荧光素) 在荧光显微镜下，

12、有活力的原生质发荧光，无活力的不发荧光。,生活力测定：,影响原生质体活力的因素,分离材料的生理状态 酶解条件 酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压 分离条件 离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间 环境条件 操作环境的温度、分离用具的影响,三、原生质体培养,原生质体培养基,原生质体培养方法,1.原生质体培养基,无机盐 大量元素浓度； NO3和NH4+的比例； Ca2+浓度 有机成分 维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。,2、原生质体培养方法,液体浅层培养 固体平板培养 固-液体双层培养 琼脂糖珠培养,原生质体培养,柑桔融合,实例,第四节 体细胞杂交,定义：将两个

13、不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A + B） 几种不同的表述： 体细胞杂交：Somatic hybridization 细胞融合：Cell fusion 原生质体融合：Protoplast fusion 无性杂交：asexual hybridization 超性杂交：Parasexual hybridization 超性融合：Parasexual fusion 细胞工程：Cell engineering,植物细胞杂交的几个重要进展 1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获

14、得再生完整植株； 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物细胞杂种； 1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术； 1978年，Melchers获得第1个属间细胞杂种（番茄马铃薯）； 1981年，Zimmerman发明电融合仪，并首次提出电融合概念； 1987年，Schweiger建立单对原生质体电融合技术程序。,体细胞杂交与有性杂交的异同,+,体细胞杂交,有性杂交,原生质体融合的有关名词-I,对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为100%） 非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对值） 胞质杂种（cytoplas

15、mic hybrid, Cybrid）：细胞质重组，细胞核未重组 对称融合（symmetric fusion） 也称标准融合（Standard fusion） 非对称融合（asymmetric fusion）：融合前对一方进行处理，使其染色体丢失一部分,原生质体融合的有关名词-II,供-受体融合：Donor-recipient fusion 体配融合（gameto-somatic fusion）（性细胞与体细胞融合） 亚原生质体-原生质体融合： Subprotoplast-protoplast fusion 小原生质体：Miniprotoplast 微原生质体：Microprotoplast

16、胞质体：Cytoplast 胞质体-原生质体融合: Cytoplast-protoplast fusion,原生质体融合的方式,化学方法：聚乙二醇法 Polyethylene glycol （PEG），与高pH高Ca结合使用 物理方法：电融合法 Electrofusion, Electrically induced fusion,理论上，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，这对种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程

17、中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。,体细胞杂交的程序及方法,原生质体融合,杂种细胞筛选,方法：PEG，电融合， NaNO3,营养互补选择法， 遗传互补选择法， 机械选择法，,形态学方法 细胞学方法 同工酶方法 分子标记法,体细胞杂种植株的鉴定,亲本A,亲本B,原生质体聚合,融合处理,分离的原生质体,原生质体融合,融合体移植,杂种融合体筛选,杂种融合体移栽 至不同的培养基,体细胞杂交筛选,原生质体培养和体细胞杂交的应用,获得新品种； 创造新种质； 转移有利性状和克服远源杂交的障碍； 作为基因工程的良好受体及进行突变体筛选的优良原始材料。,第五节 植物细胞突变体的

18、离体筛选,在离体培养条件下，诱发突变的突变型和自发突变没有本质上的差别。一般都在三个水平上发生： 基因组突变：染色体数目的改变或细胞质基因组的增减； 染色体突变：染色体较大范围的结构变化，涉及多个基因； 基因突变：指范围在一个基因以内分子结构的 改变。按DNA改变方式有碱基置换突变，移码突变，缺失突变和插入突变。 体细胞无性系变异：Somaclonal variation,一、突变体的产生,二、突变细胞的筛选方法,直接选择法 正选择/负选择,间接选择法,正选择,用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的

19、筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。 贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有1.4 NaCl的N6培养基上直接筛选出小麦耐盐系。分析显示，耐盐系游离氨基酸含量是供体亲本的4.1倍。 郑企成等也曾将小麦“京花1号”花药经射线处理后，再经0.5 NaCl培养基直接筛选获得耐盐再生株系。 李爱贤等以甘薯“栗子香”为材料诱导胚性细胞系，从900个通过射线辐射的细胞团中，在含有2.0 NaCl的培养基中进行筛选，获得22个抗盐愈伤组织，并获得20个抗盐再生植株。,负选择,一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标

20、的筛选方法。 Dorffling等以Pro类似物羟脯氨酸（HYP）为选择剂，获得了耐HYP的体细胞变异系，其抗寒性比供体亲本增强，且能稳定遗传。 林定波等将锦橙株心细胞愈伤组织的悬浮细胞经射线照射，然后在高浓度脯氨酸培养基中培养筛选，获得了抗寒体细胞变异愈伤组织，并再生植株。鉴定显示，抗寒愈伤组织及其再生植株的抗寒性分别比供体提高1.4和2.4，突变系体内的Pro含量比供体增加了一倍。,三、突变性状遗传基础及其稳定性鉴定,遗传基础,稳定性,突变性状的遗传学基础,体细胞变异，除发生在染色体水平外，更多的是基因水平上的变异。 从利用体细胞变异的角度，染色体变异大多是一些畸形变异，真正可利用的染色体

21、变异十分有限。 基因水平上的变异在表型上大多只是个别性状的改变，不会影响再生植株的正常生长发育。因此，从再生植株的这些变异中有可能筛选有益的变异。 基因水平上的变异，从根本上讲是DNA的碱基突变或修饰状态的改变。,突变性状的稳定性,对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实。 Brettell等从645株玉米杂种胚培养再生植株中，发现了一个稳定突变体Adh1（乙醇脱氢酶突变体），克隆基因序列分析发现，该基因第七外显子中一个编码谷氨酸的GAG中的A转换成为了T，使翻译肽链中的谷氨酸转变为纈氨酸。 植物的许多性状

22、特别是经济性状均由多基因控制，对于多基因控制性状的碱基突变可能由于技术上的复杂性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。,Genetic Engineering and Breeding,第六节 基因工程与育种,植物基因工程（plant genetic engineering）：指以类似工程设计的方法，按照人们的意志，通过一定的程序，将具有遗传信息的DNA片断，在离体条件下，用工具酶加以剪切、组合和拼接，再将人工重组的基因引入适当的植物受体中进行复制和表达的技术。 转基因植物：transgenic plant 转基因技术: Transgenic technique,一、Definitio

23、n,指把不同生物有机体的DNA（或基因）分离提取出来，在体外进行酶切和连接，构成重组DNA (recombination DNA)分子，然后转化到受体细胞（如,大肠杆菌），使外源基因在受体细胞中复制增殖，然后借助生物的或理化的方法将外源基因导入到植物细胞，进行转译和表达。,基因工程:,基因分离、克隆,农杆菌介导,基因枪介导,基因插入Ti/Ri质粒载体,农杆菌侵染植物,包裹DNA的微粒弹,质粒DNA制备,基因质粒进入植物细胞,DNA整合进植物染色体,基因枪轰击植物细胞,检测转基因,筛选转基因细胞,转基因细胞再生植株,检测转基因,农杆菌和基因枪介导基因转化流程图,基因工程的基本步骤和方法,目的基因

24、的分离与鉴定 植物表达载体的构建 植物的遗传转化 转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定,各种来源目的基 因的分离与克隆,克隆基因的鉴定和分析,有用基因的亚克隆,待改良植物的选择和预处理,植物受体细胞系统制备,植物细胞的遗传转化,异源基因在植物细胞中 的整合与表达,转基因植株的育成和转化,含异源基因的重组细胞的筛选和培养,重组细胞的分裂与分化,植物基因转移的过程,二、基因工程在园艺植物育种中的应用,改良品质 提高抗病虫能力 改良抗逆性 提高光合作用和固氮效率 创建雄性不育材料 延迟成熟与保鲜 选育抗除草剂品种,提高抗病能力,抗细菌基因工程途径:,过量表达法 克隆转化溶菌酶基因或杀菌肽基因,抗真菌

25、基因工程途径:,克隆并导入几丁质酶基因和-1,3-葡聚糖酶基因 克隆并导入抗毒素,过量表达来自番茄PR蛋白的甜橙抗脚腐病,过量表达CTV CP蛋白的来檬抗CTV,The p25 coat protein (CP) gene of Citrus tristeza virus (CTV) was incorporated to Mexican lime plants and forty-two transgenic lines were produced, 25 containing the p25 CP gene of the severe CTV strain T-305 and 17 wit

26、h that of the mild strain T-317. When plants propagated from each transgenic line were graft-inoculated with CTV T-305 or aphid inoculated with T-300, two types of response to viral challenge were observed: some lines developed CTV symptoms similar to those of non-transgenic controls, whereas others

27、 exhibited protection against the virus. This protection consisted of a proportion of plants, ranging from 10 to 33%, that were resistant to CTV, and the rest of them that showed a significant delay in virus accumulation and symptom onset. Protection was efficient against non-homologous CTV strains

28、and was generally accompanied by high accumulation of p25 CP in the protected lines, which suggest a CP-mediated protection mechanism in most cases.,Molecular Breeding 2002 ,10: 110,实例,CTV symptoms of different intensity in young leaves after graft-inoculation with CTV T-305. Severe leaf distortion

29、and stunting symptoms in a non-transgenic control plant (left), delay in virus infection and symptom attenuation in a transgenic plant (centre), and resistance against CTV T-305 in other transgenic plant (right).,如.1986年Beachy等将烟草花叶病毒的外壳蛋白基因（TMV-CP)导入烟草中，发现转基因植株发病时间明显延迟或病毒的症状明显减轻。,抗病毒基因工程途径:,向植物中导入病

30、毒外壳蛋白（CP）,转移病毒的反义RNA,卫星RNA,病毒复制酶基因和核酶基因等,转病毒CP基因番木瓜,CK,Trans,fire blight抗性:1000ha apple were killed by FB in Michigan in 2000. Lytic protein (LP)：Royal Gala, Galaxy 和M26 转avian LPs SB-37,T-4 lysozyme：Gala 转harpin（来于Fire blight细菌） NPR1蛋白：过量表达 Silencing the DIPM kinase which is related to the occurren

31、ce of the disease.,实例：苹果,转attacin LP基因的Royal Gala,4年田间试验表明：抗性增强，果实 品质正常。,转attacin基因的苹果抗fire blight,转avian lysozyme基因的Royal Gala,转Harpin基因的苹果与对比,抗感fire blight苹果的比较,抗fire blight病的转基因苹果,提高抗虫能力,苏云金芽孢杆菌（Bt)制剂产生的原毒素伴孢晶体毒蛋白（内毒素），可在昆虫幼虫中肠道的水解酶作用下，转化成小分子的毒素多肽，而对多种昆虫有很强的毒杀作用。,导入Bt毒蛋白基因,Hinder等将编码豇豆胰蛋白酶抑制物（CpT

32、I)的基因转移到烟草中，明显增强了转基因烟草对烟草夜蛾幼虫的抗性。,如将蜘蛛杀虫肽基因导入烟草，转基因烟草表现出对棉铃虫有较强的抗性。,利用一些昆虫毒素基因,导入蛋白酶抑制剂,改善抗逆性,如：甜菜碱醛脱氢酶（BADH)基因导入烟草、草莓和水稻后，转基因植物的耐盐性明显提高。,向植物中导入热休克基因，可提高其抗热性,将深海鱼美洲拟鲽的抗冻基因通过柱头导入番茄，获得可耐受-4 -5低温的转基因番茄。,导入与脯氨酸或甜菜碱合成有关的酶的基因,转基因烟草的光合特性,1 处理4h，27 测定光合作用，低温导致的光合作用下降率为：转拟南芥菜的为7，转南瓜的为88，对照的为25。,转基因植株的脂肪酸的构成,

33、转入抗寒性强的拟南芥菜的基因，其不饱和脂肪酸的含量显著增加 转入抗寒性弱的南瓜的基因，其饱和脂肪酸的含量显著增加,转基因烟草的抗寒性,转基因烟草在1 下处理10d，25 栽培2d，前者无黄化，后者有黄化。 a.野生型；b.对照pBI121；c.南瓜；d.拟南芥菜,选育抗除草剂品种,把除草剂作用的靶酶或靶蛋白质的基因导入植物 现已在矮牵牛、烟草、番茄、马铃薯、大豆、油菜、杨树等植物上获得抗除草剂的转基因植株。,转移一种能以除草剂为底物的酶的基因,如bar基因编码PPT乙酰转移酶，导入烟草，番茄和马铃薯等植物后，使作物获得抗除草剂PPT的能力,延迟成熟与保鲜,改变果实细胞壁降解酶活性 抑制成熟激素

34、乙烯的生成 美国Calgene公司以将反义PGcDNA导入到番茄中，育成“FLAVR SAVE”转基因品种，并已上市 叶志彪等利用ACC氧化酶反义基因转入番茄，抑制ACC合成酶的表达活性，抑制乙烯的合成，育成耐贮藏的转基因番茄。,苹果乙烯形成的沉默,实例,乙烯生成减少70% 需更长时间软化 硬度：高于CK 比CK耐贮藏,转基因苹果,转基因与对照苹果,室温贮存 3个月,提高产量,提高光合作用效率和固氮效率 克隆与杂种优势相关的植物雄性不育有关的基因 目前已克隆出许多种参与光合作用的基因和导致植物雄性不育的基因 Worral等报道用编码-1,3葡聚糖水解酶基因转化烟草、矮牵牛获得雄性不育植株,改良

35、品质, 将人工合成的富含必须氨基酸的DNA片段导入马铃薯，能有效地改善马铃薯贮藏蛋白的氨基酸成分。 通过导入淀粉粒结合的淀粉合成酶 的反义RNA基因，可改变马铃薯支链淀粉和直链淀粉的比例。, 陈章良将Chs的反义基因转入矮牵牛中，导致Chs 的mRNA水平以及Chs的酶活性都大大降低，可改变矮牵牛的颜色。, 异戊烯转移酶基因(ipt)导入番茄可使果实可溶性固形物含量显著增加。,MdTFL（抑制芽分生组织identity基因）：苹果顶端分生组织从营养期向生殖期的转变,提前开花结实,实例： 苹果 早花 早实,嫁接后8个月,早花苹果的花和果实,转Leafy基因杨树早花,三、转基因植株的筛选,方法： 形态学鉴定 直接选择法 间接选择法 同工酶测定 分子标记,第七节 分子标记与育种Molecular marker & breeding,形态标记（morphological markers） 细胞学标记（cytological markers） 生化